Identification of Mycobacterium species by multiplex PCR assay

Abstract
Multiplex polymerase chain reaction (PCR) is a potentially useful diagnostic tool for fast and accurate identification of clinically relevant non-tuberculous mycobacteria (NTM) and Mycobacterium tuberculosis (TB). This multiprimer system is able to identify the 32-kDa antigen present in most Mycobacterium genus species, the IS6110 insertion sequence belonging to the TB complex and the species-specific sequence of the mtp40 gene in TB. One hundred and eight randomly selected sputum and extra-pulmonary samples from the Reference Center Laboratory for Public Health in the State of Santa Catarina (LACEN/SC) were processed and analyzed at the Laboratory of Molecular Biology and Mycobacteria (LMBM), Federal University of Santa Catarina, Florianopolis, Brazil, between January and June 2011, representing 30% of the positive samples received annually at LACEN/SC. Of the 108 isolates, 80% were identified as TB and 20% as NTM. The multiplex PCR results were compared with PCR-restriction enzyme analysis of the hsp65 gene (PRA-hsp65), demonstrating 100% concordance (Kappa index 1). Multiplex PCR is a superior tool to differentiate between TB and NTM when used in combination with biochemical tests and culture. In addition, it is more cost effective than other molecular biological assays and has been used as an epidemiological tool in strain classification and in distinguishing TB from NTM. Multiplex PCR is fast, sensitive and specific in mycobacteria identification and is, therefore, useful for routine clinical laboratory assays.

Key words
tuberculosis, multiplex pcr, molecular biology

Artículo completo
Introdução e objetivos

A (La) identificação do complexo Mycobacterium tuberculosis e das (y de las) micobactérias não-tuberculosas (MNT) é importante para epidemiologia, controle das doenças e da (de las enfermedades y de la) efetividade do tratamento.^1,2 O controle da tuberculose (TB) requer a (requiere la) identificação, o tratamento e as (y las) informações epidemiológicas sobre o controle da infecção, assim como as (así como las) infecções com MNT tem sido associadas com uma variedade de problemas (pulmonares, em linfonodos, na pele, tecidos moles (en la piel, tejidos blandos), esqueleto, infecções disseminadas e surtos nosocomiais (brotes nosocomiales) relacionados com dificuldades diagnósticas, identificação e tratamento. Devido ao fato (al hecho) de que a maioria das MNT é intrinsicamente resistente aos (a los) tuberculostáticos de primeira linha, a identificação das espécies é importante para o controle das infecções e efetividade do tratamento.^3-5 Em Santa Catarina, a incidência estimada é de (es de) 1 500 novos casos de TB por ano (por año); o Estado está entre os com (entre aquellos con) menor incidência no (en el) país (27/100 000 habitantes). Entretanto (Sin embargo), alguns municípios apresentam incidência igual ou maior à do (o más elevada que la de) Brasil (45/100 000 habitantes), por exemplo, Itajaí e Joinville, com 84.7 casos por 100 000 habitantes, e 46.2 casos por 100 000 habitantes, respectivamente, e a incidência de MNT é de 1.2% dos casos por ano, e têm sido identificadas principalmente de sítios extra-pulmonares.^6,7

Os métodos convencionais para identificação de micobactérias envolvem o (involucran el) cultivo em meios (en medios) sólidos ou líquidos, seguido da observação do crescimento e da (y de la) produção de pigmentos. Além disso, testes (Además, análisis) bioquímicos como a produção de niacina, redução de nitrato e o teste da catalase (de la catalasa) termo estável, também são necessários.⁸

Reações de PCR multiplex oferecem identificação rápida e acurada das (y exacta de las) espécies. Esta técnica, sensível e específica, está baseada na (basada en la) amplificação de sequências hábeis a (con capacidad para) diferenciar o complexo Mycobacterium tuberculosis e as MNT.^9-11 A proteína espécie-específica mtp40 pode ser utilizada no diagnostico da TB porque não está presente em Mycobacterium bovis BCG, a sequência de inserção IS6110 está presente em várias cópias dispersas no genoma dos membros (de los miembros) do complexo Mycobacterium tuberculosis e o gene que codifica o antígeno alfa de 32-kDa está presente em todas as micobactérias, sendo alvo (y es blanco) potencial para triagem diagnóstica molecular.^12-14

O presente estudo apresenta um teste de PCR multiplex útil para discriminar bactérias do complexo M. tuberculosis, M. tuberculosis e MNT no (en el) diagnóstico molecular de rotina.



Métodos

Isolados (Aislamientos) clínicos

Cento e oito isolados (Ciento ocho aislamientos) clínicos selecionados randomicamente entre amostras de escarro e (muestras de esputo y) extra-pulmonares do Laboratório Central de Saúde Pública do Estado de Santa Catarina (LACEN/SC) foram processados e analisados no Laboratório de Biologia Molecular e Micobactérias (LBMM) da Universidade Federal de Santa Catarina. Esses isolados obtidos (obtenidos) entre janeiro e junho de 2011 representam 30% das amostras positivas recebidas anualmente pelo (por el) LACEN/SC.


Baciloscopia e cultura (cultivo)
As baciloscopias foram realizadas no Setor de Tuberculose do LACEN/SC. Cada amostra clínica foi cultivada em meio de (en medio de cultivo) Ogawa-Kudoh, incubada a 37°C por 4 semanas, seguindo rigorosamente as instruções do fabricante do meio (Laborclin^®-Brazil).


Cepas de referência

Para as reações (las reacciones) de padronização foram utilizados DNA obtidos das cepas referência M. tuberculosis H37Rv, M. bovis ATCC00020, M. avium ATCC25398, M. fortuitum ATCC6841, M. gordonae ATCC00161, M. kansasii ATCC12498 e (y) M. bovis BCG ATCC19274.


Extração de DNA

Os (Los) DNA das culturas (de los cultivos) de micobactérias foram extraídos utilizando a metodologia CTAB descrita por Van Soolingen e colaboradores.¹⁵

PCR Multiplex

As reações (50 µl) foram feitas (han sido realizadas) com a mistura (la mezcla) de 50-100 ng de DNA, 2.5 mM de MgCl₂ (Invitrogen^®), 1U de Taq DNA polymerase recombinant (Invitrogen^®, USA) e 25 pmol de cada primer: PT1 ePT2 para amplificar um produto de 395 pares de bases (pb) da sequência espécie-específica mtp40; IS5 e IS6 para amplificar 984 pb do elemento de inserção IS6110; MT1 e MT2 para amplificar 506 pb do gene que codifica o antígeno alfa de 32kDa (Tabela 1). Foram adotadas as (Se adoptaron las) seguintes condições para as reações de PCR multiplex: 94°C por 1 minuto, pareamento a 71°C por 90 segundos, e extensão a 72°C por 2 minutos em 30 ciclos e extensão final a 72°C por 10 minutos.¹¹ Os produtos amplificados foram revelados em (se revelaron en) gel de agarose a 1% contendo brometo de etídio e visualizados com luz ultravioleta.






Resultados

Do (Del) total de 108 isolados, 80% foram identificados como Mycobacterium tuberculosis e 20% como MNT. Os resultados da PCR multiplex (Figura 1) foram comparados com os resultados do método PRA-hsp65 (PCR - seguida de restrição enzimática)¹⁶ e apresentaram 100% de concordância (Tabela 2) (índice de concordância kappa 1). A PCR multiplex é uma ferramenta (constituye uma herramienta) excelente para diferenciação do complexo M. tuberculosis das MNT, especialmente se utilizada em associação com a cultura e os testes (el cultivo y los análisis) bioquímicos. Além disso (Además), a PCR multiplex apresenta maior custo efetividade (mayor costo eficacia) se comparada com outros testes moleculares, e tem sido empregada (y ha sido utilizada) como uma ferramenta epidemiológica para classificação de estirpes e (cepas y) distinção entre o complexo M. tuberculosis e as MNT.











Discussão

O gênero Mycobacterium é representado por uma ampla gama de espécies, que formam um grupo heterogênio em termos de ocorrência em (en términos de) variedade de materiais clínicos, complexos fenotípicos, dados (datos) genéticos e associação com doenças (con enfermedades).¹⁷ Atualmente, a identificação convencional das micobactérias isoladas em cultura é obtida por meio (se obtiene por medio) de métodos fenotípicos (bioquímicos) e aspectos relativos ao crescimento no meio (al crecimiento en el medio de cultivo) (tempo de crescimento e pigmentação); pelas (por las) dificuldades desses testes (de estos análisis), poucas micobactérias são identificadas desta forma.¹⁸ A determinação dos achados (de los hallazgos) fenotípicos é demorada (requiere más tiempo), extremamente trabalhosa, e dificilmente assimilada como um método diagnóstico preciso uma vez que nem sempre é (no siempre es) reprodutível.¹⁹ Dessa forma, esforços para se obter um (los esfuerzos para lograr un) método de identificação molecular tem sido empreendidos (han sido realizados), a PCR multiplex envolvendo três (involucrando tres) produtos é um método altamente sensível, específico e permite identificar e diferenciar os principais (los principales) grupos. Este sistema foi baseado na (tuvo como base la) amplificação simultânea do gene espécie-específica mtp40, sequência de inserção IS6110, e o gene do antígeno alfa de32-kDa, em um único passo. M. tuberculosis pode ser identificado e diferenciado de M. bovis e de outras micobactérias não-tuberculosas. O sistema multiplex não deixaria (no dejaría) de detectar a micobactéria em uma possível ausência da IS6110 em algumas estirpes, uma vez que fragmentos de DNA correspondentes a amplificação do gene espécie-específica mtp40 e do gene do antígeno alfa de 32-kDa ainda estariam (aún estarían) presentes. PCR Multiplex tem sido aplicada no (en el) laboratório de biologia molecular e micobactérias como triagem para identificação e auxílio ao (al) diagnóstico convencional. Testes de PCR Multiplex são tecnicamente mais (son técnicamente más) exigentes do que os (que los) protocolos das PCR convencionais. Esses problemas técnicos incluem competição e ou (incluyen competencia y/u) homologia entre os iniciadores escolhidos (elegidos), temperaturas de pareamento e concentração dos iniciadores (de los iniciadores). Embora diferentes PCR multiplex tenham sido descritas para diferenciação de complexo M. avium e M. intracellularae,²⁰ complexo M. tuberculosis e M. bovis,²¹ complexo M. tuberculosis e complexo M. avium.²² Os isolados identificados como MNT foram identificados com a técnica PRA-hsp65. Os resultados do presente estudo mostraram a capacidade da ferramenta PCR multiplex para diferenciar espécies de M. tuberculosis de outras espécies de micobactérias, entretanto deve ser associada com a cultura e provas (y análisis) bioquímicas para obter (lograr) melhores resultados. A PCR Multiplex possibilita a amplificação simultânea de dois ou mais loci gênicos em uma (dos os más loci génicos en una) única reação.

Infelizmente a padronização de uma reação PCR multiplex é desafiadora (es desafiante) porque há (existe la) necessidade de empregar (utilizar) diferentes pares de iniciadores para cada locus que será amplificado, cada um requerendo (cada uno de ellos requiere) diferentes condições de amplificação e de estringência (y de astringencia). A sensibilidade e a (y la) especificidade do método dependem da seleção da sequência alvo, e quando a (y cuando la) PCR multiplex é utilizada como auxiliar nas triagens de rotina do (em las selecciones de rutina del) LBMM/UFSC, tem se mostrado útil para diferenciar M. tuberculosis das MNT. A PCR multiplex in house que padronizamos é uma ferramenta com relação custo efetividade superior a outros testes moleculares.

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