Retrospective Diagnosis of Citomegalovirus Congenital Infection

Abstract
Cytomegalovirus is the most common congenital viral infection. It´s cause of many abnormalities involving the central nervous system. Because of its mainly asymptomatic, two thirds of the sequelae occur in asymptomatic at birth child.



After the first 2-3 weeks of life, the viral DNA detection on dried blood sample from the neonatal screening has been proposed as an ideal and unique method of certainty for retrospective diagnosis.



The technique is carried out by dilution and extraction-amplification, resulting in less than 48 hours. It have been published a variable number of protocols in the literature that refer variables in vitro sensitivities depend mainly on the extraction method from the heel prick and amplification that are heterogeneous (between 35%-98%). The sensitivity is greater if it is secondary to primary infection, in selected patients, using a good method of extraction and amplification and amplification doubled or even tripled. The specificity is consistent in all of them reaching almost 100%. The viral load test of the voucher is underestimated but highly related to that of fresh blood and although it may not have viremia at birth, viraemic infants have higher risk of developing neurosensory sequelae, making clinical detection rates in patients selected are high.



Described the feasibility of alternatives such as the umbilical cord in Japan, and in recent years, the use of dried urine on filter paper, reported good results.

Key words
congenital citomegalovirus infection, retrospective diagnosis

Artículo completo
El citomegalovirus (CMV) es la infección viral congénita más frecuente, con una prevalencia del 0.4% a 2.3%.¹ Las tasas se modifican en función de la variación en la seroprevalencia y son más altas en Estados Unidos (1.4% en Washington,² 1.3% en Alabama³) y menores en Europa, donde se sitúan entre el 0.3 y el 0.6%.^4-7 El CMV constituye el 60% de las infecciones congénitas y es la principal causa de deficiencia neurosensorial adquirida intraútero.

La seroprevalencia en embarazadas varía del 35% al 95%.^8,9 Las principales sociedades científicas no recomiendan la realización de cribado serológico sistemático debido a la ausencia de vacuna eficaz, escasas pruebas de eficacia de medidas preventivas y terapéuticas, dificultad para diagnosticar una reactivación y posibilidad de infecciones congénitas sintomáticas en hijos de mujeres inmunes.¹⁰ En España, un estudio de 2011 publica una seroprevalencia global del 62.8% en mujeres.¹¹ Las tasas de seroprevalencia han disminuido en los últimos años,¹⁶ lo que podría conducir a un aumento del número de infecciones congénitas en el futuro.

También, se desconoce la prevalencia de la infección congénita en el recién nacido. Así, en España, con más de 490 000 nacimientos anuales¹⁰ y con una prevalencia global estimada del 0.5%, el CMV afectaría a 2 450 recién nacidos cada año, 245 podrían ser sintomáticos, 10 fallecerían y 410 presentarían secuelas a largo plazo (123 en niños sintomáticos al nacimiento y 287 en niños asintomáticos).

La infección puede ser secundaria a primoinfección materna o a una recurrencia. La primoinfección tiene consecuencias más graves, sobre todo durante la primera mitad del embarazo. La posibilidad de transmisión es mayor en el tercer trimestre.^{13, 14}

La transmisión madre-hijo es, principalmente, el resultado de una primoinfección (1% a 4% de las mujeres seronegativas durante el embarazo¹⁵) y conlleva un riesgo de transmisión del 24% al 75% (promedio de 40%).^{16, 17} La reactivación sucede en el 10% a 30% de embarazos, y el riesgo de transmisión es del 1% al 3%.¹⁵ Se refirieron casos de transmisión debido a reactivación en 1% al 22% del total.^{17, 28} Sin embargo, cada vez hay más datos firmes acerca de que la evolución de una infección congénita secundaria a reactivación puede ser sintomática y grave.^{19, 20}

La infección se presenta con amplio espectro de manifestaciones, desde asintomáticas hasta síndrome congénito muy grave. Solo del 10% al 12% están sintomáticas en el período neonatal.^4,15,18 Las petequias, hepatoesplenomegalia, ictericia y microcefalia constituyen el cuadro más frecuente. Son menos habituales la prematuridad, retraso de crecimiento intraútero, coriorretinitis y calcificaciones cerebrales.

En general, entre el 10% y el 20% de los afectados exhibirán daño neurológico en el seguimiento posterior. Esta cifra que se eleva hasta el 60% en el caso de recién nacidos sintomáticos.^{1, 7, 17} El CMV es causa de múltiples anomalías que envuelven al sistema nervioso central, como retraso mental, autismo, trastornos del aprendizaje, parálisis cerebral, epilepsia y déficit visual y auditivo. Entre los casos asintomáticos al nacimiento, del 11% al 13.5% desarrollarán secuelas permanentes en los años siguientes.^{4, 18 21}

Los hallazgos neurorradiológicos incluyen lesiones multifocales o difusas, fundamentalmente en la sustancia blanca profunda (más acusadas en regiones parietales), ventriculomegalia, calcificaciones intracraneales, vasculopatía de las arterias tálamoestriadas, atrofia cerebral y encefalopatía destructiva con anormalidades en las circunvoluciones o sin estas. La presencia de anomalías en la parte anterior del lóbulo temporal, incluidos los quistes subcorticales, es especialmente sugestiva.^22,23 Los factores de peor pronóstico cognitivo son la microcefalia y las anomalías en la neuroimagen.²⁴

El síntoma más frecuente es la hipoacusia, presente en el 10% al 15% de los casos y hasta en el 30% al 65% si la infección fue sintomática en período neonatal. Acontece prácticamente con la misma frecuencia en niños sintomáticos con afectación del SNC o sin esta, y está especialmente ligado a la presencia de petequias, hepatitis y retraso del crecimiento intrauterino al nacimiento.²⁵ Es bilateral en dos tercios de los niños, puede ser fluctuante y progresar durante la infancia en el 30% al 80%,¹⁷ de forma tal que, hasta en la mitad de los casos, es de establecimiento tardío durante los primeros 6 años de vida.^{26, 27} Se estima que la infección congénita es responsable del 15% al 20% de la sordera neurosensorial en la infancia.^{28, 29} De otra manera, entre el 35% y el 65% de los casos sintomáticos (en los que suele ser más temprano y grave) y del 7% al 15 % de los asintomáticos acabarán desarrollando hipoacusia, con una media de edad al establecimiento de 44 meses.^{2, 17, 26, 30} Un programa de pesquisa neonatal de hipoacusia detectará menos de la mitad de los casos de sordera causados por la infección congénita. Los pacientes con cargas virales más altas en sangre y orina tienen mayor riesgo de desarrollar hipoacusia neurosensorial, independientemente de si son sintomáticos o no.^{31, 32}

Koyano et al refieren, en 2011, que hasta un 25% de los casos de retraso mental de causa desconocida están asociados con la infección y la mitad de las secuelas son de establecimiento tardío.³³ Zucca y col., en 2003, la señalan en 4 de cada 10 pacientes con malformaciones corticales.¹

La incidencia de coriorretinitis varía del 15% al 30% en sintomáticos; es inusual en asintomáticos; y es rara su progresión posnatal.^{10, 34, 35}

La mayoría de las infecciones en embarazadas son asintomáticas. El diagnóstico más fiable se establece mediante seroconversión, pero documentarlo es difícil, puesto que el estado serológico antes de la gestación frente a CMV no es habitualmente conocido. La detección de IgM constituye un marcador de infección activa o reciente. Limita su valor diagnóstico que la sensibilidad de distintos productos comerciales varía entre el 30% y 88%.¹⁶ También, se positiviza en reactivaciones/reinfecciones y, además, son relativamente frecuentes los falsos positivos en sujetos con otras infecciones virales (Epstein-Barr, parvovirus B19). Ciertos hallazgos recientes indican que menos del 10% de las mujeres IGM positivas infectan al feto.³⁶ Suele negativizarse entre los 3 y 4 meses, pero puede persistir hasta 6 a 9 meses después del final de la fase aguda.³⁷ La presencia de IgM combinada con índice de baja avidez tiene el mismo valor que una seroconversión.^{16, 36, 38} (IgG de baja avidez parecen corresponderse con una infección primaria en los 2 y 3 meses previos). La antigenemia y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) tienen baja sensibilidad para detectar transmisión vertical.^{10, 16, 36}

El diagnóstico fetal se establece mediante amniocentesis, a partir de la semana 21 a 22 (el feto comienza a excretar orina a partir de la semana 19 a 20) con un intervalo de 6 a 8 semanas tras la infección materna. La sensibilidad y especificidad del cultivo del líquido amniótico y de la PCR es del 70% al 80%; del 100%; del 90% al 98%; y del 92% al 98%, respectivamente. Si ambos son negativos, queda excluida la infección y, si son positivos, se recomienda la determinación de PCR cuantitativa, asumiendo que por debajo de 1 000 copias/ml hay bajo riesgo de enfermedad sintomática. Por el contrario, la presencia de más de 100 000 copias/ml tiene una alta especificidad en el diagnóstico de la infección congénita sintomática.^{16, 39} Para diagnosticar la afectación fetal, la ecografía tiene escasa sensibilidad, ya que los hallazgos ecográficos detectarán menos del 5% de los fetos infectados.⁴⁰ La realización de resonancia magnética fetal aumenta la sensibilidad y la especificidad.¹⁰ Sin embargo, solo una tercera parte de los niños con infección sintomática presenta hallazgos en las pruebas de imagen durante el embarazo.⁴¹

El diagnóstico de infección congénita en período neonatal depende del aislamiento del virus en orina o la detección del ADN viral mediante PCR en sangre, orina, saliva o líquido cefalorraquídeo durante las 2 a 3 primeras semanas de vida. El método diagnóstico ideal es el cultivo viral en orina o saliva, pero cada día es más utilizada la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), a través de la amplificación del ADN viral. Esta resulta de elevada sensibilidad y especificidad. Demler y Warren^{42, 43} determinaron del 93% al 100% y del 89% al 95% de sensibilidad y especificidad, respectivamente.

También, es diagnóstica la detección de antigenemia o de anticuerpos IgM frente al CMV, aunque la sensibilidad es inferior (del 30% al 40%, y 70%, respectivamente) ^{31, 44} y su negatividad no invalida el diagnóstico. Además, la IgM puede tener falsos positivos, por lo que siempre debe confirmarse mediante cultivo o PCR.

El cultivo viral convencional es muy poco utilizado porque los resultados pueden demorarse 2 semanas.¹⁰ El cultivo de orina en la prueba de cultivo acelerado es el método diagnóstico más utilizado por su rapidez (24 h) y alta especificidad. Sin embargo, la sensibilidad es algo más baja (94%), por lo que, ante la sospecha clínica, debe repetirse una segunda muestra o realizar una PCR en orina, que en muchos centros se considera la técnica de referencia por su alta sensibilidad.^{31, 44, 45} La PCR en sangre también tiene buena sensibilidad, aunque la carga viral puede ser muy baja en pacientes asintomáticos o poco sintomáticos. Las PCR en saliva, y especialmente en LCR, presentan una sensibilidad más baja y no deben ser las únicas herramientas en el diagnóstico.^{10, 46, 47}


Ante la falta de un cribado habitual, algunas infecciones poco sintomáticas y la inmensa mayoría de las asintomáticas pasan desapercibidas al nacimiento. El porcentaje de secuelas en los niños con infección asintomática es bajo, de alrededor del 13%. Sin embargo, debido a que la infección congénita es mayoritariamente asintomática, dos terceras partes del total de las secuelas se producen en niños sin síntomas al nacimiento.⁴ En los niños con infección sintomática no diagnosticada, las secuelas de la infección son mucho más significativas. Estos niños habitualmente se diagnostican de enfermedades neurodegenerativas de peor pronóstico, como leucodistrofias o leucoencefalopatías ^{22, 23, 48}

En cuanto al diagnóstico retrospectivo, pasado el período que incluye las primeras 2 a 3 semanas de vida, ninguno de los procedimientos anteriores permite diferenciar infección congénita de adquirida.

En la última década, se ha ido estableciendo el papel de la detección de ADN del virus en la muestra de sangre de papel de filtro procedente de la pesquisa neonatal realizada para despistaje endocrino-metabólico, proponiéndose como método ideal y único de certeza para un diagnóstico retrospectivo.

Esta muestra se extrae en la primera semana de vida para el cribado neonatal de metabolopatías y se almacena, posteriormente, en cada comunidad autónoma durante períodos prolongados, habitualmente entre 1 y 5 años. Su aporte más significativo, en relación con el diagnóstico virológico convencional, es la posibilidad de diferenciar si la infección es congénita o perinatal a una edad en que los análisis de la virología clásica no lo logran. Se conserva a temperatura ambiente y el envío de las muestras no tiene inconvenientes.

La leucoencefalopatía de la infección congénita por CMV plantea el diagnóstico diferencial con enfermedades neurodegenerativas y la confirmación de dicha infección como causa permite asegurar el carácter no progresivo de la leucoencefalopatía, a diferencia de las de origen metabólico, obviar estudios extensos y costosos y mejorar los resultados diagnósticos en el grupo global de las leucoencefalopatías, de las que hasta un 50% pueden quedar sin diagnóstico. En el caso de la hipoacusia, secuela permanente más frecuente y que pasa inadvertida en más de la mitad de los casos, atribuir como responsable a la infección congénita también permite obviar otros estudios (no realizados con tanta frecuencia en el caso de las hipoacusias), mejorar los resultados diagnósticos en este grupo, descartar un origen genético y, con ello, el riesgo de repetición.
A fines de 1985, se desarrolló la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa, lo que permitió, en 1994, el diagnóstico de infección congénita por CMV en muestras de sangre de 11 recién nacidos en comparación con el aislamiento viral. En ese mismo año, Shibatta lo publicó por primera vez sobre la muestra de sangre seca del papel de filtro de la pesquisa neonatal;⁴⁹ posteriormente, el método fue simplificado por Barbi y colaboradores, en 2000, y confirmado en sucesivos estudios.^{50, 51}

La técnica se lleva a cabo mediante dilución, amplificación y extracción, con resultado definitivo en menos de 48 horas y con escaso costo en relación con otras técnicas. Las aplicaciones han sido diversas. Además de confirmar el momento de la infección intraútero, se ha utilizado para validar criterios de resonancia magnética como predictores de infección por citomegalovirus,²² estimar el impacto de la infección congénita por CMV como etiología de la sordera neurosensorial⁵¹ y para estudios de prevalencia en diferentes países.⁸

La conservación de la muestra tiene lugar a temperatura ambiente dada la estabilidad del ADN sin constatarse una pérdida de sensibilidad, y se obtuvieron resultados positivos hasta 18 años después.⁵² En 2006, Scanga demostró que es posible el diagnóstico en muestras recogidas 20 meses antes⁵³ y Soetens, en 2008, refirió muestras positivas tras casi 11 años.⁵⁴ En 2009, se demostraron casos de CMV detectable en la prueba del talón en niños de hasta 17 años, y el porcentaje de detección por grupos de edad no pareció declinar en edades mayores. En dos preparados con sangre CMV positiva, Atkinson obtuvo un decremento progresivo de la carga viral conforme pasaba el tiempo hasta los 2 años, sobre todo a partir de los 18 meses, pero siempre fue detectable, a pesar de que la carga viral inoculada fue moderadamente baja (15 000 a 10 000 copias/ml). Aunque si se hiciera regresión lineal, esto podría significar que la carga viral podría ser indetectable a los 28 meses. Este hecho no parece suceder en vivo porque no podría acontecer que niños de 17 años fueran positivos a menos que la carga viral al nacimiento fuera superior a 10,⁸ cuando la carga viral excepcionalmente es superior a 10.⁶ Es decir que es posible que, después de una fase inicial de declinación, permanezca estable a cargas bajas durante largos períodos.⁵⁵

La posibilidad de contaminación horizontal de tarjetas adyacentes fue referida por Johansson en 1997, pero no se ha confirmado por distintos grupos.⁵² En un estudio en 2009, se introdujeron 3 controles negativos en contacto con 3 positivos y fueron probados en forma repetida mensualmente durante dos años y no existió contaminación.⁵⁵

Esta técnica ha mostrado una sensibilidad del 71% al 100% y una especificidad del 99% al 100% comparada con el cultivo de orina.⁵¹ Además, puede tener un valor pronóstico, ya que los niños con hipoacusia presentan cargas virales más altas en sangre seca.⁵⁶ El único problema es que la prueba pierde sensibilidad en niños con cargas virales bajas al nacimiento (< 10⁴ copias/ ml). Por lo tanto, la determinación de la PCR para CMV en sangre seca debe reservarse de entrada para estudios epidemiológicos y para el diagnóstico retrospectivo de la infección, pero no debe sustituir al cultivo o a la PCR en orina como pruebas de elección en el diagnóstico del recién nacido.

Repasando la historia reciente de los trabajos publicados, a continuación se muestra un breve resumen. En 2006, en series de 500 y 900 neonatos, se observó una sensibilidad y especificidad del 100% y 99%, respectivamente, al efectuar la comparación con el cultivo de orina de la misma forma en casos sintomáticos que asintomáticos.⁷ Una sensibilidad discretamente inferior indican Johansson (que aplica esta técnica en niños de 12 a 18 años) y Yamamoto, aunque manteniendo la especificidad en torno al 100%. ^{52, 57} Atribuyen esta menor sensibilidad a una posible inhibición de la técnica de PCR con el paso del tiempo. Un estudio de prevalencia en Portugal en el que se usó el protocolo modificado de Barbi demostró una sensibilidad y especificidad del 93% y 100%, respectivamente.⁵⁸ En contraste con lo anterior, el estudio prospectivo y de gran tamaño de la muestra llevada a cabo por Boppana y colaboradores indica que, aunque mantiene una excelente especificidad, cercana al 100%, la sensibilidad de la determinación fue de un 34%, muy lejos de lo publicado hasta entonces. Estos hallazgos parecen no corresponderse a un método de pesquisa inferior al utilizado previamente, sino que sugieren que no todos los niños con infección congénita por CMV permanecen virémicos al nacimiento.⁵⁹

Con lo referido hasta ahora se deduce que, aunque la sensibilidad varía entre el 35% y el 98% según lo publicado, la especificidad en todos ellos es concordante y alcanza casi el 100%, de forma que una determinación negativa no lo excluye, pero una positiva prácticamente lo confirma.

Como hemos visto la reacción en cadena de la polimerasa en la prueba del talón inicialmente fue propuesta como un método de diagnóstico retrospectivo,^{1,22,52,53,57,60,61} pero, posteriormente, también lo fue para su uso como método de pesquisa.⁷ Ha sido publicado un número variable de protocolos en la bibliografía,^{52,53,57,60,61,62,63} algunos ya nombrados anteriormente, que refieren variables sensibilidades in vitro dependiendo, fundamentalmente, del método de extracción.
Comparando la sensibilidad de la detección de ADN de CMV en la prueba del talón referida por cuatro grandes series que ya hemos nombrado, se ha visto que varía entre el 34% y 100%.^54,55,60 La comparación entre los estudios es problemática,⁶⁴ por lo que, inicialmente, se deben comparar las principales características de estas cuatro series. La primera fue la de Barbi, en 2000, que obtuvo una sensibilidad del 81.9% a 100% y una especificidad del 92.2% a 99.7%. Se diseñó de forma retrospectiva, incluyendo a 509 pacientes, con una seroprevalencia en ese país en la gestante en torno al 79%. El criterio de inclusión utilizado fue la presencia de síntomas compatibles o la primoinfección materna. Hubo 72 neonatos con infección confirmada, se usaron 3 discos de 9 mm de la muestra de sangre seca de la prueba del talón y la extracción fue mediante shock templado.⁶⁰

En la segunda serie, de Soetens, en 2008,⁵⁴ se obtuvo una sensibilidad del 73% al 83%. La seroprevalencia comunicada en esa población estuvo en alrededor del 50%. En este caso también el diseño fue retrospectivo, pero se llevó a cabo con la finalidad de pesquisa universal sin seleccionar pacientes y la infección se confirmó en 55 neonatos. Se utilizó toda la muestra de sangre seca (10 mm) de la prueba del talón; la extracción fue con fenol-cloroformo (83% sensibilidad) y con EasyMAG (Biomerieux) (73% sensibilidad).

Posteriormente, Atkinson,⁵⁵ en 2009, presenta una nueva serie, también de diseño retrospectivo, que incluyó 70 neonatos con infección ya confirmada por CMV. Utilizan la mitad de la muestra (5mm), el kit comercial QiaAmp DNA Blood miniKit (Qiagen) y obtienen una sensibilidad del 72% al74%.

En 2010, Boppana⁵⁹ presenta resultados dispares. Se analizan de forma prospectiva 20 448 neonatos en una población con alta seroprevalencia estimada (en torno al 70%) a modo de pesquisa universal y se observan 92 neonatos con infección congénita confirmada. Se utilizan dos discos (6milímetros), la extracción se lleva a cabo con el kit Qiagen M48 (Qiagen) y se obtiene una baja sensibilidad, de entre 28% y 34%, aunque con una especificidad del 99.9%.

En el último estudio publicado de nuestro conocimiento,⁶⁵ se analizan en una población con una seroprevalencia estimada del 50% de forma prospectiva 271 neonatos de riesgo (síntomas compatibles o primoinfección materna) y se obtienen 64 casos de infección confirmada. Se utiliza toda la muestra disponible (10 mm) y se extrae con el kit comercial QiaAmp DNA Blood mini kit modificado (Qiagen) y con fenolcloroformo, obteniéndose una sensibilidad del 96.9% al 100% y 95%, respectivamente, y una especificidad del 98.1% al 99% y 98.5%, respectivamente. Leurez-Ville y colaboradores analizan las principales razones para la discrepancia entre los resultados. En primer lugar, el tamaño de la muestra, ya que un tamaño mayor podría aumentar la sensibilidad de la muestra. En segundo lugar, las características de la población por estudiar, ya que, cuando se aplica a poblaciones de alto riesgo y no como pesquisa universal, la sensibilidad es alta. La sensibilidad a través de pesquisa también fue muy alta (82%) cuando se aplicó en un país de baja seroprevalencia.⁵⁴ En este mismo estudio, la sensibilidad fue mayor cuando la responsable era una primoinfeción respecto de una reactivación o reinfección (82% frente a 54%), lo que podría relacionarse con una supuesta carga viral más baja en el segundo caso. Además, en el estudio reciente e importante de Boppana,⁵⁹ la determinación tuvo escasa sensibilidad (34%) y, en este caso, la proporción de infección tras reinfección o reactivación no se publicó, pero es probable que fuera alta porque la mayoría de las madres procedían de grupos étnicos con alta seroprevalencia de CMV.⁶⁶

En 2008, Barbi y colaboradores llevaron a cabo un examen externo de calidad en la detección de ADN mediante PCR en la prueba del talón. Participaron 27 laboratorios, 28 mediante una PCR en tiempo real y 5 con PCR convencional. Obtuvieron un resultado positivo correcto en 91% de los casos en aquellas muestras cuya carga viral superaba los 8.8*10⁴ copias/ml, un 59% y un 12% con cargas virales de 9.4*10³ y 7.3*10³ copias/ml, respectivamente. Así, el estudio reveló un límite muy escaso de detección (8.8*10⁴ copias/ml), lo que estableció una urgente necesidad de mejorar los distintos métodos de detección a partir de la muestra de sangre seca del papel de filtro, incluyendo la optimización de la utilización del mínimo tamaño de muestra para una detección exitosa. Como causa más probable de falsos positivos (9% de laboratorios y 11% de los datos), se identifica la pérdida de adhesión a las estrictas medidas de seguridad, cuyo objetivo es evitar la posibilidad de contaminación y transferencia.⁶⁷ No hay estándares internacionales disponibles y se ha demostrado que la amplificación del ácido nucleico por métodos como la PCR varía considerablemente entre laboratorios. La influencia del método de extracción y del área utilizada de la muestra de sangre seca podrían explicar los resultados discordantes del primer ensayo clínico europeo sobre la detección de ADN de CMV en la prueba del talón en el rango de carga viral baja. Como puntos críticos, Barbi enumera el método de elución y extracción, la cantidad de papel manchado, las características individuales de las pruebas de PCR y el criterio para considerar la positividad.

En las diferencias también pueden influir la parte del genoma de CMV que es detectada y las condiciones de almacenamiento de la muestra. Sin embargo, el mayor factor responsable de las discrepancias entre estudios son las diferencias en los métodos de extracción desde la prueba del talón,⁶⁸ que son muy heterogéneos.⁶⁹ La evaluación de distintos métodos de extracción y amplificación realizada por De Vries, en 2009, mostró claramente que algunos métodos reportan mayor sensibilidad variando del 32% al 73%.⁶³ De Vries compara un panel de métodos de extracción de ADN desde la prueba del talón disponibles actualmente,^{50,53,57,60,62} apuntando de entrada que es difícil la comparación por diferencias entre los estudios en relación con el origen y volumen de las muestras. Las variables potenciales que influencian la sensibilidad son el origen de la muestra, la cantidad de volumen de sangre seca, el volumen de elución y el método de amplificación. Como ejemplos aportados en este estudio, con el QuiAmp DNA Blood Mini Kit (Qiagen), se ha referido una sensibilidad del 95% con una carga viral de 3.6 log10 copias/ml en un experimento con sangre diluida de un paciente trasplantado,⁶² mientras que, con una modificación del anterior, se ha conseguido una sensibilidad del 100% en la prueba del talón de 7 neonatos con CMV congénito, de los que solo 3 eran sintomáticos.⁵³ Como ya se ha referido anteriormente, Soetens reporta una sensibilidad del 73% de la extracción con Nuclisens EasyMAG cuando realizan 53 pruebas del talón de neonatos con infección congénita (de los que solo 2 fueron sintomáticos).⁵⁴ Considerando la extracción de ADN con medidas de “shock templado”, Yamamoto aporta una sensibilidad del 71.4% en combinación con una n-PCR convencional cuando efectúan la prueba del talón de 7 neonatos infectados (de los que 5 fueron sintomáticos).⁶⁷ El radio de sensibilidad mayor usando este modo de “shock templado” fue obtenido por Barbi, cuyo método tuvo una sensibilidad del 100% cuando se llevó a cabo la prueba en 72 neonatos infectados (26 sintomáticos) usando una muestra de 3 mm probada en triplicado.⁵⁰ En el estudio de De Vries, de 2009, la potencial influencia de diferencias fue excluida por usar idénticas muestras clínicas de pacientes trasplantados que contenían ADN extracelular e intracelular, idénticos volúmenes de entrada y salida, e idénticos métodos de amplificación para todas las muestras examinadas. La muestra fue pequeña y el poder del estudio no permitió detectar otras diferencias significativas. El protocolo que resultó más sensible de los comparados en este estudio fue el descrito por Barbi y colaboradores, modificado y no modificado, el QiAamp DNA Investigator kit, el BioRobot Universal System y el Magna Pure LC. Para todos ellos, la mayor sensibilidad fue alcanzada cuando fueron la prueba se efectuó en triplicado. El protocolo triplicado de Barbi resultó en una sensibilidad del 100%-86%-50%, con cargas virales de 5-4, 4-3, 3-2 log10 copias/ml. Considerando la rentabilidad, el protocolo de Barbi tiene la ventaja de menor costo (menos de 0.30 euros por muestra frente a otros de 7 a 15 euros por muestra.).⁶³

Göhring, en 2010, estudia y compara los resultados en cuanto a sensibilidad, combinando distintos métodos de extracción y técnicas de PCR.⁶⁹ Ya Soetens, en 2008, demostró que la combinación de Easy Mag DNA extracción con un protocolo de PCR convencional presentó una sensibilidad de solo el 45%.⁵⁴ Atkinson, combinando la extracción con el kit comercial de Qiagen y una PCR en tiempo real (Taq Man), haciendo diluciones seriadas para cuantificación y analizando todas las muestras por triplicado obtuvo una sensibilidad del 72% al 74%.⁵⁵ En este estudio, el punto de corte para la detección positiva fue de 1 500 copias/ml de sangre completa, una comparación que resulta favorable con el estudio de calidad externo de Barbi, en 2008, en el que el 50% de los laboratorios obtuvieron como valor límite 9 300 copias/ml.⁶⁷ En el estudio de Göhring, la combinación más sensible consistió en una PCR convencional usando iniciadores de la región 1E1E4 y extracción con fenolcloroformo utilizando parches de 1*6-3*3 de sangre seca o el QIAmp blood DNA Minikit con la totalidad de la muestra de sangre seca. Usando una PCR en tiempo real con hibridación en prueba, la mayor sensibilidad resultó de la extracción con fenolcloroformo y el QIAmp Blood Mini Kit usando la totalidad de la muestra. El peor resultado lo obtuvieron NucliSense Easy Mag y la extracción templada, que fueron ineficaces (las muestras de extracción templada frecuentemente fueron hemolíticas, lo que podría explicar la pérdida de sensibilidad en el Light Cycler System, debido a efectos inhibitorios de la sangre contaminada.) Así concluyen que, si se tiene en cuenta que la carga viral media en sangre de cordón publicada por Halwach fue de 2 300 copias /ml,⁷⁰ la mejor combinación de extracción y amplificación puede consistir en extracción con fenolcloroformo o QIAamp Blood Mini Kit en combinación con una n-PCR convencional usando al menos una tarjeta completa de sangre seca. Esto conlleva fuertes implicaciones de cara al diagnóstico retrospectivo, ya que la gran mayoría de los neonatos infectados son asintomáticos con cargas virales bajas al nacimiento y solo podrían ser detectados por la combinación óptima. Para el diagnóstico de rutina, el QIAmp Blood Mini Kit podría ser una buena solución sensible y viable.⁶⁹ En 2008, Soetens confirma también estos resultados.⁵⁴ Es sorprendente que el método de extracción templada descrito por Shibatta y modificado por Barbi no fuera eficaz. Estos resultados conflictivos podrían ser explicados por el protocolo modificado publicado por De Vries en 2009, en el que las muestras fueron inicialmente incubadas a 4 ºC durante una noche antes de la incubación a 55 ºC.⁶³ En este estudio se crea un modelo logístico que ayuda a identificar el mínimo número de copias de ADN necesarias para detectar CMV de distintas áreas de muestra mediante distintas combinaciones de métodos con una probabilidad del 99%.
Así se sabe que la sensibilidad de la detección de ADN de CMV en la prueba del talón es mayor si la infección es secundaria a una primoinfección materna, si se utiliza un buen método de extracción y amplificación, y que una amplificación duplicada o, incluso, triplicada es importante para alcanzar una óptima sensibilidad (la duplicación de la prueba incrementó la sensibilidad de un 58% al 73% en el estudio de Soetens en 2008).^{54, 69}

Para concluir, Atkinson determina, en 2009, que la prueba del talón sí es valorable en el diagnóstico retrospectivo de niños con CMV congénito hasta la edad de 17 años, con una elevada sensibilidad y especificidad en los casos de pérdida auditiva causada por el CMV. Además, añade que, usando la extracción semiautomática EasyMAG (Biomerieux System 2007), se ha demostrado el beneficio añadido de menor tiempo. En todo caso, los resultados han de interpretarse con precaución como parte de un proceso diagnóstico, y un resultado negativo no permite excluir totalmente el CMV como causa.⁵⁵

También, se han descrito las ventajas adicionales de la PCR en tiempo real sobre la n-PCR convencional, como son un menor riesgo de contaminación, una mayor facilidad de implementación y un menor costo. El primer estudio que muestra una amplificación con PCR en tiempo real fue el de Scanga, en 2006, en el cual se validan los métodos de amplificación en tiempo real, en lugar de la PCR convencional, con el fin de disminuir el tiempo empleado, mejorar el tiempo de carga y descargas y minimizar el riesgo de contaminación. En este caso se utilizan siete casos confirmados y siete controles, usando toda la muestra (10 mm en lugar de 3 mm) y se añaden un paso con lisado adicional para aumentar el volumen recogido. En este caso, la sensibilidad y especificidad fue del 100%.⁵³ El inconveniente teórico es que la sensibilidad de esta muestra no es tan baja como la descrita en la PCR convencional (1 600 copias/ml frente a 400 copias/ml).^{1, 60, 61}

Diversos estudios han sido publicados sobre la carga viral en sangre de los neonatos infectados. Halwach-Bawman⁷⁰ reportó una media de carga viral en sangre venosa de cordón de 2 300 (3.4 log10) copias/ml sin encontrar diferencias entre sintomáticos y asintomáticos. En contraste con lo anterior, numerosos estudios han referido niveles de ADN de CMV significativamente mayores en sintomáticos que asintomáticos.^{31, 32, 44} Boppana³² reporta una media de carga viral en sangre periférica de 4*10⁵ (5.6 log 10) en 18 neonatos infectados sintomáticos, significativamente mayor que en 58 asintomáticos (8.2*10⁴ o 4.9 log10). Además, entre los asintomáticos, los que en el seguimiento hacían pérdida auditiva tenían una carga viral mayor que aquellos que no (8.7*10⁵ contra 1.1*10⁴⁾ Los mismos resultados obtienen Lanari³¹ y Revello⁴⁴ con una carga viral significativamente más alta en sintomáticos frente asintomáticos (3.2 log10/ 10⁵ PMNL copias/ml y 3 000 copias/10⁵ PBL frente a 2.8 log10 copias/10⁵ PMNL y 30 copias/10⁵ PBL). En el estudio de De Vries, el 86% de sensibilidad del protocolo de Barbi se obtuvo con 3 a 4 log10 copias/ml,⁶³ lo que, combinado con los resultados de Halwach, conllevaría que una cantidad de casos no fueran detectados a pesar de utilizar el método más sensible disponible. El estudio de calidad externa de Barbi indica que, si tenemos en cuenta el dato de Halwach (carga viral media de 2 300 copias/ml), menos del 50% de todos los laboratorios podrían ser capaces de identificar recién nacidos congénitamente infectados, ya que solo unos pocos laboratorios fueron capaces de detectar cargas de 730 copias/ml.⁶⁷

Se ha descrito que puede no haber viremia en el momento del nacimiento,³ pero los datos ya expuestos sugieren que los recién nacidos virémicos al nacimiento tienen más riesgo de desarrollar síntomas neurológicos y que cargas virales más altas están asociadas con más grave pérdida auditiva.^{32, 56} Por ello la explicación de que la prueba del talón haya resultado positiva en los casos más afectados podría explicar la detección continuada en niños mayores. En 2007, Vauloup-Fellous sugieren que la cuantificación de la carga viral de la prueba del talón está infraestimada respecto a las muestras de sangre fresca, con una diferencia media de 0.73 log10 genoma/copias/ml. También, refieren que fueron significativamente mayores en neonatos sintomáticos que asintomáticos y en aquellos con pérdida auditiva.⁶² Este resultado es consistente con los de Boppana, en 2005, y Lanari, en el que el 90% de los recién nacidos que desarrollarían pérdida auditiva tienen cargas virales al nacimiento superiores a 1 000 copias/ml.^{31, 32} Los valores límites de detección de ADN de CMV estuvieron en el rango referido en la bibliografía en su mayoría (2 000 a 4 000 copias/ml)^{53, 62} y son mucho más altos que los obtenidos usando sangre fresca (rango de 50 a 500 copias/ml). Esto se debe a la cantidad de sangre extraída (50 microlitros comparada con 200 a 500 microlitros de sangre fresca) y a que el protocolo de extracción usado es menos eficaz que con sangre fresca. Sin embargo, aunque la sensibilidad in vitro puede ser relativamente baja, los ratios de detección clínica son, en general, altos en pacientes seleccionados.

En el estudio de Leurez-Ville, en 2011, la carga viral de los sintomáticos fue significativamente mayor con el primer protocolo (PCR en tiempo real diseñada por el propio laboratorio y amplificada en duplicado respecto al kit comercial CMV PCR kit [Abbott] en una amplificación única).⁶⁵

También, Vauloup-Fellous⁶² y Walter y colaboradores, en 2008,⁵⁶ demuestran que la cuantificación de ADN a partir de la prueba del talón basada en el kit de extracción QiAmp DNA Blood Mini Kit estuvo altamente relacionada con la cuantificación hecha en sangre fresca. Así, en algunos casos, podría tener, incluso, un valor pronóstico debido al gran número de estudios que han referido asociación entre elevada carga viral al nacimiento y presencia de secuelas.^{32, 56, 62}

En los últimos años, se ha descrito la viabilidad de otra alternativa para detectar la infección congénita, argumentando la insuficiente sensibilidad de la muestra de sangre seca de la prueba del talón como estrategia de pesquisa. El uso de orina seca en papel de filtro ha sido sugerida por Nozawa⁷¹ y Koyano³³ porque la orina habitualmente contiene cargas virales de CMV mayores que en sangre. Es probable que los métodos de extracción de la muestra de sangre seca sean aplicables a la orina. En 2011, Koyano lleva a cabo la determinación en más de 21 000 recién nacidos a modo de pesquisa en 6 áreas geográficas de Japón. La infección congénita por CMV fue identificada en 66 casos (0.31%) y se obtuvo un valor predictivo positivo de la pesquisa del 94%. En 12 y 23 de los casos positivos, se realiza la determinación también en la prueba del talón y en el cordón umbilical, detectándose en 9 de los 12, mediante la prueba del talón y, en todos ellos, mediante el cordón umbilical. La carga viral del papel de filtro resultó acorde con la carga viral de la orina diluida, y la de la muestra de sangre seca de la prueba del talón fue acorde justo también con la de una muestra de sangre fresca. Ambas cargas virales en orina fueron mayores que en sangre. La implantación rutinaria de la recogida de una muestra de orina en papel de filtro al nacimiento no supondría una carga excesiva, pero sí cierto trabajo añadido. Las limitaciones de estos trabajos es que no se han comparado con el estándar de oro, por lo que no se pueden descartar falsos negativos, aunque es esperable que con las elevadas cargas virales en orina la sensibilidad aumente, y que esta sea mayor del 90%.

Otra muestra propuesta como arma de diagnóstico retrospectivo, fundamentalmente en Japón, ha sido el cordón umbilical. Por prácticas culturales, cuando se cae el cordón umbilical, este se preserva en casa, limpio y seco, como símbolo del vínculo madre-hijo durante años, mientras que la muestra de sangre seca del papel de filtro de la pesquisa neonatal habitualmente es desechada en torno al año. Son varias las series que demuestran la detección de ADN de CMV en el cordón umbilical después de varios años. Ogawa,⁷² en 2006, y Tagawa,⁷³ en 2009, determina el 15% y 12% de infección congénita entre pacientes afectados de hipoacusia bilateral profunda, respectivamente.

Para finalizar, una reflexión sobre la conveniencia o no de la implantación de la pesquisa universal de infección congénita por citomegalovirus y, en tal caso, cuál debería ser el método empleado. En la actualidad, no existe una pesquisa neonatal implementada en países desarrollados para el diagnóstico de la infección congénita por citomegalovirus. Las causas fundamentales por las que esto es objeto de debate son la incidencia de la infección congénita y la gran importancia como etiología de la sordera neurosensorial. Se asumen dos beneficios teóricos de la implantación de la pesquisa universal, que son la identificación de niños en riesgo para el establecimiento tardío o progresión de hipoacusia y la aplicación del tratamiento para prevenir dicho establecimiento. El Colegio Americano de Genética Médica define principios básicos para que una afección pueda ser sometida a pesquisa universal, prueba disponible con apropiada sensibilidad y especificidad y beneficios demostrados, derivados de la rápida detección, como la intervención a tiempo y tratamiento eficaz. Leurez-Ville⁶⁵ propone que la detección de ADN de CMV mediante PCR de la muestra de sangre seca de la prueba del talón parece ser un eficaz método de identificación de neonatos en alto riesgo de secuelas a largo plazo. Si la implementación de una pesquisa universal fuera considerada, el uso de esta podría ser la vía más práctica y de fácil implantación junto con el programa de pesquisa metabólico universal. También, De Vries⁶³ propone que el protocolo de Barbi y el BioRobot Universal System son los candidatos más apropiados para ello. Sin embargo, solo el estudio dirigido por Boppana en 2010⁵⁹ ha llevado a cabo una pesquisa de infección congénita por CMV en una escala que se aproxima a lo que podría ser una pesquisa universal y obtuvo, como ya se ha comentado, muy baja sensibilidad y especificidad. Si la no aplicación de tratamiento conllevara inevitablemente discapacidad o muerte, o un tratamiento altamente eficaz estuviese disponible, un ratio relativamente alto de falsos positivos podría ser aceptable; sin embargo, este no es el caso. Aproximadamente, el 80% de los neonatos con infección congénita no tienen síntomas ni secuelas a largo plazo. En la actualidad, el tratamiento está reservado para neonatos sintomáticos, que pueden, en su mayoría, ser detectados clínicamente y confirmados con las pruebas disponibles. Además, los casos sintomáticos parecen beneficiarse de la terapia antiviral en relación con la audición e índices de desarrollo, pero no es curativa y no previene toda la discapacidad.⁷⁴ No está claro, por lo tanto, que exista ninguna prueba de diagnóstico de infección congénita por CMV con la suficiente sensibilidad y especificidad a partir de la prueba del talón para ser considerado susceptible de aplicar como pesquisa. Otros fluidos corporales, como la saliva o la orina, podrían ser superiores a las muestras de sangre porque la cantidad de virus en estos fluidos es consistentemente mayor. La colección de saliva u orina en papel de filtro podría ser, en último lugar, una aproximación más eficaz que el uso de la muestra de sangre seca del papel del filtro de la pesquisa neonatal. Así, el beneficio de de una temprana detección para intervención y tratamiento de los casos que no son clínicamente aparentes necesita ser mejor definido. Aunque esta posibilidad no es convincente todavía, podría ser un valioso instrumento de salud pública en la actualidad.

Bibliografía del artículo
1. Zucca C, Binda S, Borgatti et al. Retrospective diagnosis of congenital cytomegalovirus infection and cortical maldevelopment. Neurology 61:710-712, 2003.
2. Misono S, Sie K, Weiss N, Huang M, Boeckh M, Norton S et al. Congenital Citomegalovirus Infection in Pediatric hearing Loss. Arch Otolaryngol Head Neck Surg 137:47-53, 2011.
3. Bradford R, Cloud G, lakeman A, Boppana S, Kimberlin D, Jacobs R et al. Detection of Cytomegalovirus (CMV) DNA by Polimerase chain reaction is associated with hearing loss in newborns with symptomatic congenital CMV infection involving the central nervous system. JID 191:227-233, 2005.
4. Dollard SC, Grosse SD, Ross DS. New estimates of the prevalence of neurological and sensory sequelae and mortality associated with congenital cytomegalovirus infection. Rev Med Virol 17:353-63, 2007.
5. Peckham C, Tookey P,Logan S,Giaquinto C. Screening options for prevention of congenital cytomegalovirus infection. J Med Screen 8:119-24, 2001.
6. Naessens A, Casteels A,Decatte L,Foulon W. A serologic strategy for detecting neonates at risk for congenital cytomegalovirus infection. J Pediatr 146:194-7, 2005.
7. Barbi M, Binda S, Caroppo S, Calvario A, Germinario C, Bozz iA, et al. Multicity Italian study of congenital cytomegalovirus infection. Pediatr Infect Dis J 25:156-9, 2006.
8. Gaytant MA, Steegers EA, Semmekrot BA et al. Congenital cytomegalovirus infection: review of the epidemiology and outcome. Obstet Gynecol Surv 57:245-256, 2002.
9. Estripeaut D, MorenoY, Ahumada-Ruiz S et al. Seroprevalencia de la infección por citomegalovirus en puérperas y su impacto neonatal. An Pediatr (Barc) 66:135-139, 2007.
10. F. Baquero-Artigao y Grupo de estudio de la infección congénita por citomegalovirus de la Sociedad Española de Infectología Pediátrica. Documento de consenso de la Sociedad Española de Infectología Pediátrica sobre el diagnóstico y el tratamiento de la infección congénita por citomegalovirus. An Pediatr 71(6):535-547, 2009.
11. DeOry F, Castañeda R, Ramírez R, Pachón I. Estudio seroepidemiológico frente a citomegalovirus en mujeres en edad fértil de la Comunidad de Madrid. Med Clin (Barc.) 111:286-7, 1998.
12. De Ory F, Ramírez R, García-Comas L, León P, Sagües MJ, Sanz JC. Is there a change in cytomegalovirus seroepidemiology in Spain? Eur J Epidemiol 19:85-9, 2004.
13. Francoual C, Rozenberg F, Gelot A. Infection maternofoetale á cytomegalovirus. Med Mal Infect 26:441-446, 1996.
14. Pinillos R, Olloqui A, Torres y col. Citomegalovirus congénito neonatal. Comunicación de un caso y revisión. Acta Pediatr Esp 67:234-238, 2009.
15. Malm G, Engman ML. Congenital cytomegalovirus infections. Semin Fetal Neonat Med 12:154-159, 2007.
16. Lazzarotto T, Guerra B, Lanari M, Gabrielli L, Landini MP. New advances in the diagnosis of congenital cytomegalovirus infection. J Clin Virol 41:192-197, 2008.
17. Fowler KB, Dahle AJ, Boppana S et al. Newborn hearing screening: will children with hearing loss caused by congenital cytomegalovirus infection be missed? J Pediatr 135:60-64, 1999.
18. Kenneson A, Canon MJ. Review and meta-analysis of the epidemiology of congenital cytomegalovirus infection. Rev Med Virol 17:253-276, 2007.
19. Boppana S, Fowler KB, Britt WS, Stagno S, Pass RF. Symptomatic congenital cytomegalovirus infection infants born to mother with preexisting inmunity to cytomegalovirus. Pediatrics 104:55-60, 1999.
20. Gaytant MA, Rours GI, Steegers EA, Galama Jm, Semmekrot BA. Congenital cytomegalovirus infection after recurrent infection: case report and review of the literature. Eur J pediatr 162:248-253, 2003.
21. Pass RF. Congenital cytomegalovirus infection and hearing loss. Herpes 12:50-55, 2005.
22. Haginoya K, Ohura T, Kon K et al. Abnormal white matter lesions with sensorineural hearing loss caussed by congenital cytomegalovirus infection: retrospective diagnosis by PCR using Guthrie cards. Brain Dev 24:710-714, 2002.
23. Van der Knaap MS, Vermeulen G, Barkhof F et al. Pattern of white matter abnormalities at MR imaging: Use of polimerase chain reaction testing of Guthrie cards to link pattern with congenital cytomegalovirus infection. Radiology 230:529-536, 2004.
24. Noyola D, Demler GJ, Nelson CT et al. Early predictors of neurodevelopmental outcome in symptomatic congenital cytomegalovirus infection. J Pediatr 138:325-331, 2001.
25. Rivera L B , Boppana S B , Fowler K B, Britt W J , Stagno S, Pass R F. Predictors of hearing loss in children with symptomatic congenital cytomegalovirus infection. Pediatrics. 110:762-7, 2002.
26. Fowler KB, McCollister FP, Dahle AJ, et al. Progressive and fluctuating sensorineural hearing loss in children with asymptomatic congenital cytomegalovirus. J Pediatr 130:624-630, 1997.
27. Dahle AJ, Fowler KB, Wright JD, et al. Longituinal investigation of hearing disorders in children with congenital CMV.J Am Acad Audiology 11:283-290, 2000.
28. Barbi M, et al. A wider role for congenital cytomegalovirus infection in sensorineural hearing loss. Pediatr Infect Dis J 22:39-42, 2003.
29. Grosse Sd, Ross DS, Dollard SC. Congenital cytomegalovirus infection as a cause of permanent bilateral hearing loss: a quantitative assesment. J Clin Virol 41:57-62, 2008.
30. Pass RF, Fowler KB, Boppana SB, Britt WJ, Stagno S. Congenital cytomegalovirus infection following first trimester maternal infection: Symptoms at birth and outcome. J Clin Virol 35:216-20, 2006. .
31. Lanari M, Lazzarotto T, Venturi V, Papa I, Gabrielli L et al. Neonatal cytomegalovirus blood load and risk of sequelae in symptomatic and asymptomatic congenitally infected new- borns. Pediatrics 117:76-83, 2006.
32. Boppana SB, Fowler KB, Pass RF, Rivera LB, Bradford RD, Lakeman FD, et al. Congenital cytomegalovirus infection: Association between virus burden ininfancy and hearing loss. J Pediatr 146:817-23, 2005.
33. Koyano S, Inoue N, Oka A,Moriuchi H, Asano K, Ito Y, et al. Screening fro congenital cytomegalovirus infection using newborn urine samples collected on filter paper: feasibility and outcomes from a multicentre study. BMJ Open 1:e000118, 2011.
34. Anderson KS, Amos CS, Boppana SB et al. Ocular abnormalities in congenital cytomegalovirus infection. J Am Optom Assoc 67:273-B, 1996.
35. Coast Dk, Demmler GJ, Paysse EA et al. Opthalmologic findings in children with congenital cytomegalovirus infection. J AAPOS 4:110-116, 2000.
36. Lazzarotto T, Gabrielli L, Lanari M, Guerra B, Belluci T, Sassi M, et al. Congenital cytomegalovirus infection: recent advances in the diagnosis of maternal infection. Hum Inmunol 65:410-415, 2004.
37. Stagno S, Pass RF, Cloud G, Britt WJ, Henderson RE, Walton OD, et al. Primaru cytomegalovirus infection in pregnancy. Incidence, transmission to fetus, and clinical outcome. JAMA 256:1904-1908, 1986.
38. Munro SC, Hall B, Whybin LR, Leader L, Robertson P, Maine GT, et al. Diagnosis of and screening for cytomegalovirus infection in pregnant women. J Clin Microbiol 43:4713-4718, 2005.
39. Guerra B, Lazzarotto T, Quarta S, Lanari M, Bovicelli L, Nicolosi A, et al. Prenatal diagnosis of syntomatic congenital cytomegalovirus infection. Am J Obstet Gynecol 183:476-482, 2000.
40. Ville Y. The megalovirus. Ultrasound Obstet Gynecol 12:151-153.[editorial], 1998.
41. Guerra B, Simonazzi G, Puccetti C, Lanari M, Farina A, Lazzarotto T, et al. Ultrasound prediction of symptomatic congenital cytomegalovirus infection. Am J Obstet Gynecol 198:380e1-7, 2008.
42. Demmler GJ, Buffone GJ, Schimbor CM et al. Detection of cytomegalovirus in urine from newborns by using polimerase chain reaction DNA amplification. J Infect Dis 158:1177-1184, 1988.
43. Warren WP, Balcarek K, Smith R et al. Comparison of rapid methods of detection of cytomegalovirus in saliva with virus isolation in tissue culture. J Clin Microbiol 30:786-789, 1992.
44. Revello MG, Zavattoni M, Baldanti F, Sarasini A, Paolucci S, Gerna G. Diagnostic and prognostic value of human cytomegalovirus load and IgM antibody in blood of congenitally infected newborns. J Clin Virol 14:57-66, 1999.
45. Distéfano A, González C, Pardón F, Sarubi MA, Canero C. Diagnóstico de la infección congénita por citomegalovirus en muestras de sangre seca de recién nacidos en la tarjeta de Guthrie. Una técnica promisoria. Arch Argent Pediatr 106(2):132-137, 2008.
46. Ross SA, Boppana SB. Congenital cytomegalovirus infection:: outcome and diagnosis. Semin Pediatr Infect Dis 16:44-49, 2005.
47. Inoue N, Koyano S. Evaluation of screening tests for congenital cytomegalovirus infection. Pediatr Infect Dis J 27:182-4, 2008.
48. Pinillos R, Llorente M, López-Pisón J et al. Infección congénita por citomegalovirus. Revisión de nuestra experiencia diagnóstica de 18 años. Rev Neurol 48:349-353, 2009.
49. Shibata M, Takano H, Hironaka T et al. Detection of human cytomegalovirus DNA in dried newborn blood filter paper. J Virol Methods 46:279-285, 1994.
50. Barbi M, Binda S, Caroppo S. Diagnosis of congenital cytomegalovirus infection via dried blood spots. Rev Med Virol 16:385-392, 2006.
51. Barbi M, Binda S, Caroppo S et al. Neonatal screening for congenital cytomegalovirus infection and hearing loss. J Clin Virol 35:206-209, 2006.
52. Johansson PJ, Jonsson M, Ahlfors K et al. Retrospective diagnostics of congenital cytomegalovirus infections by polimerase chain reaction in blood stored on filter paper. Scan J Infect Dis 29:465-468, 1997.
53. Scanga L, Chaing S, Powell C, et al. Diagnosis of human congenital cytomegalovirus infection by amplification of viral DNA from dried blood spots on perinatal cards. J Mol Diagn 8:240-245, 2006.
54. Soetens O, Vauloup-Fellous C, Foulon I, et al. Evaluation of different cytomegalovirus (CMV) DNA PCR protocols for analysis of dried blood spots from consecutive cases of neonates with congenital CMV infections. J Clin Microbiol 46:943-946, 2008.
55. Atkinson C, Walter S, Sharland M, et al. Use of stored dried blood spots for retrospective diagnosis of congenital CMV. J Med Virol 81:1394-1398, 2009.
56. Walter S, Atkinson C, Sharland M, Rice P, Raglan E, Emery VC, et al. Congenital cytomegalovirus: association between dried blood spot viral load and hearing loss. Arch Dis Child Fetal Neonatal 93:280-285, 2008.
57. Yamamoto AY, Mussi-Pinhata MM, Pinto PC et al. Usefulness of blood and urine samples collected on filter paper in detecting cytomegalovirus infection by the polimerasa chain reaction technique. J Virol Methods 97:159-164, 2001.
58. Paixao P, Almeida S, Gouveia P, Vilarinho L, Vaz R. Prevalence of human cytomegalovirus congenital infection in Portuguese newborns. Eurosurveillance 14:1-3, 2009 (www.eurosurveillance.org).
59. Boppana B, Ross A, Novak Z et al. Dried Blood spot real-time polimerase chain reaction assays to screen newborns for congenital cytomegalovirus infection. JAMA 303:1375-1382, 2010.
60. Barbi M, Binda S, Primache V, et al. Citomegalovirus detection in guthrie cards: a powerful tool for diagnosis congenital infection. J Clin Virol 17:159-65, 2000.
61. Distefano AL, Alonso A, Martin F, Pardon H. Human cytomegalovirus: detection of congenital and perinatal infection in Argentina. BMC Pediatr 4:11, 2004.
62. Vauloup-Fellous C, Ducrox A, Couloigner V, et al. Evaluation of cytomegalovirus (CMV) DNA quantification in dried blood spots:retrospective study of CMV congenital infection. J Clin Microbiol 45:3804-3806, 2007.
63. De Vries JJ, Claas EC, Kroes AC, Vossen AC. Evaluation of DNA extraction methods for dried blood spots in the diagnosis of congenital cytomegalovirus infection. J Clin Virol 46:37-42, 2009.
64. Dollard S, Schleiss MR, Grosse SD. Public health and laboratory considerations regarding newborn screeniing for congenital cytomegalovirus. J Inherit Metabol Dis 33:5249-5254, 2010.
65. Leurez-Ville M, Vauloup-Fellous C, Couderc S, Parat S, Castel C, Avettand-fenoel V, et al. Prospective identification of congenital cytomegalovirus infection in newborns using real-time polymerase chain reaction assays in ddried blood spots. Clin Infect Dis 52:575-581, 2011.
66. Kharrazi M, Hyde T, Young S, Amin MM, Cannon MJ, Dollard SC. Use of screeening dried blood spots for estimation of prevalence, risk factors, and birth outcomes of congenital cytomegalovirus infection. J Pediatr 157:191-197, 2010.
67. Barbi M, MacKay WG, Binda S, Van Loon AM. External quality assessment of cytomegalovirus DNA detection on dried blood spots. BMC Microbiol 8:2, 2008.
68. Dollard S, Scheleiss MR. Screening newborns for congenital cytomegalovirus infection. JAMA 304:407-408, 2010.
69. Göhring K, Dietz K, Hartleif S, Jahn G, Hamprecht K. Influence of different extraction methods and PCR techniques on the sensitivity of HCMV-DNA detection in dried blood spot (DBS) filter cards. J Clin Virol 48:278-281, 2010.
70. Hallwach-Baumann G, et al. Human citomegalovirus load in various body fluids of congenitally infected newborns. J Clin Virol 25:81-87, 2002.
71. Nozawa N, et al. Real-time PCR assay using specimens on filter disk as a template for detection of cytomegalovirus in urine. J Clin Microbiol 45:1305-1307, 2007.
72. Ogawa H, Baba Y, Suzutani T, Inoue N, Fukushima E, Omori K. Congenital cytomegalovirus infection diagnosed by polimerase chain reaction with the use of preserved umbilical cord in sensorineural hearing loss children. Laryngoscope 116:1991-1994, 2006.
73. Tagawa M, Tanaka H, Moriuchi M, Moriuchi H. Rtetrospective diagnosis of congenital cytomegalovirus infection at a school for the deaf by using preserved dried umbilical cord. J Pediatr 155:749-751, 2009.
74. Pass R. Dried blood spots and universal newborn screening for congenital cytomegalovirus infection. Clin Infect Dis 52:582-584, 2011.