Immunologic characteristics of mesenchymal stem cells

Abstract
Although bone marrow is the main source, mesenchymal stem cells have already been isolated from various other tissues, like liver, pancreas, adipose tissue, peripheral blood and dental pulp. These plastic adherent cells are morphologically similar to fibroblasts and have a high proliferative potential. This special group of cells possesses two essential characteristics: self-renewal and differentiation into various cell types, with appropriate stimuli. Mesenchymal stem cells are considered immunologically privileged, since they do not express costimulatory molecules on their surface, required for complete T cell activation. Several studies have shown that these cells exert an immunosuppressive effect on cells from both innate and acquired immunity. These properties of mesenchymal stem cells make them a promising strategy in the treatment of immune mediated disorders, like graft-versus-host disease and autoimmune diseases, as well as in regenerative medicine. The understanding of immune regulation mechanisms of mesenchymal stem cells, and also those involved in the differentiation of these cells in various lineages is primordial for their successful and safety application in several areas of medicine.

Key words
mesenchymal stem cells, immunosuppression, immune system

Artículo completo
Introdução

As células-tronco mesenquimais (MSCs) são células aderentes ao plástico e morfologicamente semelhantes aos fibroblastos, que apresentam duas características fundamentais: a capacidade de auto-renovação e a de multidiferenciação, sob condições apropriadas.¹ A multipotencialidade das MSCs foi evidenciada em diferentes estudos, onde foi demonstrada a capacidade de diferenciação osteogênica, condrogênica, adipogênica e até neurogênica destas células.^2-5 Devido a estas propriedades especiais, somadas à disponibilidade destas células nos mais variados tecidos, alta capacidade proliferativa, assim como ausência de entraves éticos e legais para sua utilização, as MSCs constituem-se em um dos mais promissores tipos de células-tronco, no que diz respeito à engenharia de tecidos e aplicação das mesmas na prevenção e tratamento de diversas doenças.^6-8
A medula óssea é a principal fonte de MSCs, as quais se situam no estroma deste tecido. Nesta localização, as MSCs fazem parte do microambiente de outra classe importante de células, as células-tronco hematopoiéticas (HSCs), sendo estas as mais bem descritas e estudadas células-tronco até o momento.^1,9 Além da medula óssea, as MSCs foram isoladas de vários outros tecidos, como pâncreas, fígado, córnea, retina, tecido adiposo, cordão umbilical, sangue periférico, intestino e polpa dentária.^2,5,10-12 A presença das MSCs em diversos sítios do organismo sugere que estas células estariam envolvidas no reparo e/ou regeneração dos tecidos ao longo da vida de um indivíduo.¹³
Embora exista uma ampla gama de marcadores positivos descritos para as MSCs, nenhum deles pode ser considerado exclusivo destas células. Por este motivo, características biológicas como aderência ao plástico, expressão de determinados marcadores e capacidade de multidiferenciação são requisitos importantes para que a célula seja considerada uma célula-tronco mesenquimal.¹ Alguns dos marcadores mais freqüentemente expressos por estas células, assim como os que apresentam pouca ou nenhuma expressão, estão listados na Tabela 1.







Vários estudos têm demonstrado a capacidade imunomodulatória das MSCs sobre diferentes células do sistema imune.^18,22-32 Esta característica das MSCs apresenta uma grande importância nos estudos sobre a biologia dos transplantes, no tratamento de doenças auto-imunes, assim como na modulação da resposta inflamatória.


Perfil imunológico das MSCs

Quando avaliadas pela citometria de fluxo, as MSCs humanas isoladas da medula óssea apresentam o seguinte fenótipo imunológico: positivas para o complexo principal de histocompatibilidade (MHC) de classe I, pouquíssima expressão de moléculas do MHC de classe II e negativas para moléculas co-estimulatórias, como CD40, CD40 ligante, CD80 e CD86.^22,23,27,33 O tratamento das MSCs com a citocina pró-inflamatória interferon gama (IFN-?) é capaz de regular positivamente a expressão de moléculas do MHC de classe I e induzir a expressão de moléculas do MHC de classe II,^22,27,34 mas não consegue modificar a expressão de moléculas co-estimulatórias.^22,27 A avaliação da expressão destas moléculas na presença de IFN-? é interessante, visto que as MSCs podem ser empregadas em sítios no organismo onde há a presença de inflamação e infecção.²⁷

A expressão de MHC de classe I pelas MSCs as protegem de mecanismos deletérios por parte das células natural killer (NK). As células NK destroem as células que apresentam pouca ou nenhuma expressão destas moléculas, como por exemplo, as células tumorais e as infectadas por vírus.³³
Quando as MSCs são induzidas a diferenciar-se nas linhagens adipogênica, osteogênica e condrogênica, as mesmas expressam moléculas do MHC de classe I, mas não moléculas do MHC de classe II. Após o tratamento com IFN-? por 48 horas, foi observado um pequeno aumento na expressão de MHC de classe II nas células diferenciadas na linhagem condrogênica, nenhuma expressão destas moléculas na linhagem adipogênica, e até uma diminuição de MHC de classe II em células diferenciadas na linhagem osteogênica, quando comparadas com as MSCs indiferenciadas.³⁴

Este fenótipo observado para as MSCs, tanto indiferenciadas como diferenciadas nas linhagens adipogênica, osteogênica e condrogênica, é considerado não imunogênico e sugere que estas células podem induzir a tolerância. As moléculas do MHC de classe I podem ativar células T alorreativas, mas na ausência de moléculas co-estimulatórias, o segundo sinal não seria ativado, levando à anergia destas células T.³

Capacidade imunomodulatória das MSCs

Normalmente, células alogênicas são destruídas pelo sistema imunológico do hospedeiro. Uma grande surpresa para os imunologistas foi justamente a observação de que as MSCs não obedecem a essas “regras” de rejeição. Além de não serem percebidas como aloantígenos, as MSCs podem suprimir a ativação e proliferação de diferentes células do sistema imunológico do hospedeiro,^{22,28,29,31,35} como ilustra a Figura 1.






Células dendríticas

Alguns estudos indicam que as MSCs podem interferir na diferenciação, maturação e função das células dendríticas,^25,30,35 as quais são as mais eficientes células apresentadoras de antígenos profissionais (APCs) do organismo, desempenhando um papel crucial no direcionamento das respostas celular e humoral contra antígenos próprios e não-próprios.³⁶ Tanto as MSCs como o seu sobrenadante podem alterar a capacidade de endocitose das células dendríticas, assim como afetar a habilidade destas células de estimular a proliferação de células T alorreativas.²⁵ Uma inibição de moléculas relacionadas à apresentação antigênica, como CD1a, CD40, CD83, CD80, CD86 e HLA-DR, foi observada durante a maturação das células dendríticas na presença das MSCs.²⁵ Esses resultados vão de encontro aos observados em outros estudos, onde as MSCs impediram a diferenciação de monócitos do sangue periférico em células dendríticas.^30,37 O perfil de citocinas secretadas pelas células dendríticas pode ser modificado pelas MSCs, estimulando a secreção de citocinas regulatórias, como a interleucina 10 (IL-10), e inibindo a secreção de fator de necrose tumoral (TNF) e interleucina 12 (IL-12), ambas citocinas pró-inflamatórias.¹⁸



Células T

Evidências mostram que quando as MSCs são cultivadas em culturas mistas de linfócitos, a proliferação de células T é suprimida.^{22,27,34,38,39} Esta capacidade de imunossupressão apresentada pelas MSCs foi demonstrada em células-tronco de diferentes espécies, como humanas,^22,23,39 murinas⁴⁰ e de primatas.⁴¹ O grau de supressão exercido pelas MSCs é dose-dependente, pois quando maiores concentrações das células-tronco são adicionadas na cultura de células, a inibição é mais pronunciada.^38,39 Alguns autores sugerem que a supressão da alorreatividade pelas MSCs é MHC independente, visto que os resultados foram similares quando foram utilizadas MSCs autólogas ou alogênicas.³⁹

As MSCs alogênicas não foram capazes de induzir a proliferação de células T, mesmo quando o meio era enriquecido com IFN-? (uma potente citocina pró-inflamatória) ou quando as MSCs eram transfectadas com moléculas co-estimulatórias. De maneira contrária, as células T responderam vigorosamente a células mononucleares do sangue periférico (PBMCs). Citocinas importantes na função de APCs, como a interleucina 1? (IL-1?), interleucina 1? (IL-1?) e TNF, foram ineficazes em gerar respostas proliferativas das células T em relação às MSCs. Este fato pode ser atribuído a mecanismos supressores ativos das MSCs sobre a proliferação das células T, mais do que à falta de imunogenicidade ou à indução de tolerancia.²⁷
As MSCs interferem na diferenciação de células TCD4⁺ em linfócitos T auxiliares. Na presença das MSCs, as células T auxiliares do tipo Th1 diminuem em 50% a produção de IFN-?, quando comparadas com culturas sem a presença das células-tronco. Inversamente, as células do tipo Th2, quando co-cultivadas com as MSCs, mostram um aumento significativo na produção de interleucina 4 (IL-4). Estes resultados indicam que as MSCs exercem um papel regulatório e antiinflamatório, direcionando o perfil de citocinas produzido por estas células.¹⁸
Os linfócitos T citolíticos (CTLs) são capazes de provocar a lise de células alogênicas após o reconhecimento do antígeno via MHC de classe I.³⁶ Quando as MSCs são adicionadas em culturas mistas de linfócitos nas fases iniciais de ativação, conseguem inibir a lise de células-alvo pelos CTLs. Entretanto, nenhuma inibição pode ser observada quando as MSCs são adicionadas na fase citotóxica destas células. Os CTLs não foram capazes de destruir as MSCs, indicando que estas células conseguem escapar do reconhecimento antigênico pelos linfócitos TCD8⁺.⁴²

As MSCs diferenciadas em adipócitos, osteoblastos e condrócitos mantêm a capacidade de inibir a proliferação de células T em culturas mistas de linfócitos.³⁴ Inclusive, a diferenciação osteogênica aumenta o efeito supressor das MSCs sobre as células T. Mesmo após o tratamento das MSCs diferenciadas (na linhagem osteogênica) com IFN-?, não foi observada uma resposta proliferativa das células T quando as duas populações celulares eram co-cultivadas.²⁷


Células B

As MSCs apresentam um efeito inibitório sobre a proliferação das células B,^28,31,43 assim como são capazes de suprimir a diferenciação terminal destas células em plasmócitos secretores de anticorpos.^28,31 Ainda, inibem as propriedades quimiotáxicas das células B, visto que as quimiocinas CXCR4, CXCR5, CXCL12 e CXCR4 ligante são negativamente reguladas na presença das MSCs.²⁸
O efeito supressor das MSCs sobre a função das células B também foi avaliado in vivo. O sobrenadante da cultura de MSCs foi capaz de suprimir a secreção dos anticorpos IgM e IgG1 em camundongos imunizados com antígenos T-dependentes e T-independentes.³¹ Estes resultados confirmam os encontrados anteriormente em estudos in vitro, onde a adição de MSCs à cultura mista de linfócitos⁴⁴ ou a co-cultura de MSCs e células B purificadas do sangue periférico²⁸ suprimiu a produção dos anticorpos IgM, IgG e IgA.



Células NK

As células NK, as quais são consideradas as principais células efetoras da imunidade inata, também são influenciadas pelo potencial imunomodulatório das MSCs. A presença de MSCs em culturas de células NK estimuladas por interleucina 2 (IL-2) conseguiu diminuir significativamente a quantidade de IFN-? produzido por estas células.¹⁸ Além disso, quando co-cultivadas com as MSCs, as células NK perdem a expressão de receptores de ativação na sua superfície, como NKp30 e NKp44. Da mesma forma, uma marcada diminuição na sua capacidade citolítica é observada.²⁹


Mecanismos imunossupressores das MSCs

Embora os dados apresentados em diversos estudos sugiram que o uso de MSCs em terapias regenerativas pode ser bem sucedido, os mecanismos pelos quais estas células não são rejeitadas pelo sistema imune do hospedeiro ainda precisam ser melhor comprendidos.³³ Foram sugeridos alguns possíveis mecanismos, como a produção de um microambiente imunossupressor pelas MSCs, a capacidade de imunomodulação do fenótipo das células imunes por estas células e, por fim, a ausência de imunogenicidade das mesmas. Possivelmente, estes mecanismos estão inter-relacionados e envolvem tanto o contato direto entre as células como mecanismos indiretos, através da produção e liberação de fatores solúveis, como as citocinas.³³
O envolvimento de moléculas solúveis na atividade supressora das MSCs sobre células T foi demonstrado em um estudo onde células TCD4⁺ e TCD8⁺ eram co-cultivadas com MSCs, mas separadas por uma membrana transwell. Apesar das células não estarem em contato direto, devido à presença da membrana, foi observada uma redução da proliferação das células T.²³ Resultados semelhantes foram encontrados por outros autores, evidenciando o efeito imunossupressor das MSCs sobre as células T²⁷ e células B³¹ mesmo na presença da membrana, indicando que o contato célula-célula não é essencial. A IL-10, o fator de crescimento transformador beta (TGF-?), o fator de crescimento hematopoiético (HGF), a prostaglandina E2 (PGE₂), a indoleamina 2,3-dioxigenase (IDO) e o óxido nítrico (NO), foram algumas destas moléculas associadas ao efeito imunossupressor das MSCs.^{18,23,33,45-47}
Outra importante molécula solúvel envolvida na regulação imune observada nas MSCs é a HLA-G5. A HLA-G é uma molécula não-clássica do antígeno leucocitário humano (HLA) de classe I, que protege o feto contra a rejeição mediada pelas células do sistema imunológico da mãe.⁴⁸ A isoforma HLA-G5, secretada pelas MSCs após o contato com células T aloestimuladas, seria responsável pelas propriedades imunomodulatórias destas células, impedindo a proliferação de células T alogênicas e induzindo a expansão de células T regulatórias (Tregs) CD4⁺CD25^highFOXP3⁺. Em relação à imunidade inata, a HLA-G5 é capaz de inibir a citólise das MSCs mediada pelas células NK, assim como a secreção de IFN-? por estas células.⁴⁹
Já para Krampera e col., o efeito inibitório das MSCs sobre as células T se deve exclusivamente ao contato direto entre os dois tipos celulares, onde as MSCs impediriam fisicamente o contato entre os linfócitos T e APCs, dificultando a apresentação antigênica e, conseqüentemente, impedindo a ativação e proliferação das células T.³⁸
Embora vários estudos tenham identificado diferentes fatores solúveis como possíveis mecanismos imunomodulatórios das MSCs, o bloqueio de qualquer uma destas moléculas isoladamente não resulta em uma perda completa da capacidade imunossupressora das MSCs, sugerindo que a regulação imune por estas células seja um fenômeno complexo, onde diferentes mecanismos agem sinergicamente.⁵⁰

As células Tregs exercem uma função importante na indução da tolerância periférica e na inibição de respostas imunes pró-inflamatórias.³² Esta população especializada de células suprime a ativação do sistema imune, mantendo a homeostase e a tolerância a antígenos próprios.¹⁸ Foi sugerido que as MSCs exercem a sua atividade imunossupressora induzindo um aumento do número de células Tregs CD4⁺CD25⁺ na população alvo.¹⁸ As MSCs, além de promoverem a expansão significativa destas células, aumentam a capacidade inibitória das mesmas.³²



Uso terapêutico das MSCs

A natureza imunossupressora das MSCs é de grande relevância clínica em relação aos transplantes alogênicos, pois esta população de células poderia, teoricamente, reduzir a incidência e a severidade da doença do enxerto-versus-hospedeiro (DEvH).³⁹ A DEvH aguda severa é uma grave complicação que pode ocorrer após o transplante alogênico de HSCs. A observação de que as MSCs induzem a inibição de culturas mistas de linfócitos e células T, independentemente do MHC, pode ter implicações clínicas importantes.
Le Blanc e col. relataram uma surpreendente melhora no quadro clínico de um menino com DEvH aguda severa no fígado e intestino, resistente ao tratamento, após tratamento com MSCs alogênicas. O paciente apresentava diarréia até 20 vezes ao dia e uma alta concentração de bilirrubina. Quatro dias após a infusão endovenosa com as MSCs (2 x 10⁶ por kg de peso), a freqüência da diarréia passou a ser de duas vezes ao dia e houve uma redução na concentração de bilirrubina.⁶

Em um estudo experimental de fase II que incluiu 55 pacientes com DEvH aguda severa, graus III e IV, resistente a esteróides, foi observada uma resposta completa em 30 pacientes e uma resposta parcial em nove, após a infusão com MSCs alogênicas isoladas da medula óssea (1.4 x 10⁶ por kg de peso). A sobrevida dos pacientes com resposta completa foi significantemente maior do que a daqueles com resposta parcial ou sem resposta ao tratamento com as MSCs.⁵¹
Vários estudos mostraram que as MSCs contribuem para o reparo tecidual e que poderiam ser empregadas para a regeneração de diferentes tecidos do organismo. MSCs alogênicas murinas injetadas diretamente sobre o miocárdio infartado ou administradas pela via endovenosa dos animais foram capazes de migrar para o local da lesão, assim como prevenir a remodelação deletéria do tecido cardíaco.⁷ Em um modelo experimental de distrofia muscular de Duchenne em camundongos, MSCs humanas isoladas da membrana sinovial promoveram o reparo do tecido muscular esquelético.⁵² Da mesma forma, o transplante de células-tronco da polpa de dentes decíduos humanos esfoliados (SHEDs), associadas à hidroxiapatita e ao fosfato tricálcio, em defeitos ósseos produzidos na calota craniana de camundongos, induziram a reparação dos defeitos com significante formação óssea local.⁵³

A osteogênese imperfeita (OI) é uma desordem hereditária grave, causada por uma deficiência na produção de colágeno do tipo I, levando o indivíduo a apresentar sintomas como fragilidade óssea e deficiência no crescimento.⁵⁴ Horwitz e col. observaram um aumento significativo na estatura, assim como na mineralização óssea em cinco crianças portadoras de OI, após o transplante de medula óssea alogênico entre irmãos HLA-compatíveis.⁵⁵ Em outro estudo, foi observada uma aceleração na velocidade do crescimento em seis crianças portadoras de OI, após infusão de MSCs purificadas da medula óssea.⁵⁶ Estes estudos indicam que o uso das MSCs nos casos de OI pode representar uma nova e promissora abordagem para o tratamento desta grave condição.
A capacidade imunomodulatória das MSCs também tem sido utilizada para o desenvolvimento de terapias para o tratamento de doenças auto-imunes.⁵⁰ Em um modelo de artrite reumatóide induzida em camundongos, a infusão sistêmica de MSCs isoladas de tecido adiposo humano reduziu significativamente a severidade da doença. As MSCs reduziram a expansão de células Th1/Th17 antígeno específicas e induziram a produção de IL-10 nas articulações e linfonodos. Ainda, foi observada a geração de células Tregs CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺ capazes de suprimir a resposta de linfócitos T auto-reativos.⁵⁷ Em relação à diabetes auto-imune tipo I, MSCs alogênicas murinas retardaram o aparecimento da doença em camundongos NOD pré-diabéticos, promovendo uma mudança em direção ao perfil Th2 da resposta imunológica.⁵⁸


Considerações finais

As propriedades imunomodulatórias das células-tronco mesenquimais, a capacidade de multidiferenciação e de regeneração de tecidos danificados, sugerem que estas células apresentam um grande potencial de uso na engenharia de tecidos e na imunoterapia.
Entretanto, estudos bem delineados in vivo a respeito da imunogenicidade, dos mecanismos envolvidos na capacidade imunomodulatória e na diferenciação das células-tronco mesenquimais, assim como a segurança de uso destas células a longo prazo, são essenciais para que se possa aplicar as terapias baseadas em células-tronco com eficácia e de forma segura no tratamento de inúmeras doenças.

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