Susceptibility to antifungal and enzyme production by Candida yeasts isolated from HIV/AIDS patients

Abstract
Thrush or Candida albicans is one of the most common fungal infections among patients with human immunodeficiency virus. The isolation, identification and evaluation of susceptibility and virulence factors of Candida yeasts from HIV/AIDS patients are provided. Samples, collected from different anatomical sites (mouth, gastrointestinal tract and vagina) of 100 patients, were grown in Sabouraud agar and identified by culture in differential medium CHROMagar Candida and by polymerase chain reaction (PCR) technique. The in vitro susceptibility test for antifungal fluconazole, amphotericin B and nystatin were determined by broth micro-dilution technique. Infectivity was assessed through the production of phospholipases and hemolysins. Candida albicans was the most prevalent among the 45 isolated yeasts, followed by C. glabrata, C. parapisilosis, C. tropicalis and C. krusei. Forty-three (95%) samples were tested for susceptibility in which minimum inhibitory concentration was determined. All isolates were susceptible to amphotericin B and nystatin, whereas 60.6% were susceptible to fluconazole; 6.9% were susceptible-dose dependent and 32.5% were resistant to fluconazole. The species C. glabrata and C. tropicalis showed higher CIMs for fluconazole than those found for C. albicans. Furthermore, 62% of samples produced phospholipase and 87% produced hemolytic activity.

Key words
Candida sp, HIV/AIDS, antifungal

Artículo completo
Introdução

Aproximadamente 34 milhões de indivíduos estão infectados pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV) no mundo.¹ De 1980 a junho de 2010, foram notificados no Brasil 492 581 casos de pacientes com a síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS), sendo identificados 115 598 casos na Região Sul.² A epidemia de AIDS é um dos desafios mais importantes da saúde pública global sendo a candidíase, uma das doenças secundárias indicativas de AIDS.³
A candidíase orofaríngea é a infecção fúngica oportunista mais frequente em indivíduos portadores de HIV.^4,5 Cerca de 90% destes indivíduos apresentam pelo menos um episódio de candidíase orofaríngea durante o curso da AIDS, e muitas vezes tem episódios recurrentes.⁶ Da mesma forma, a candidíase vaginal pode persistir em sucessivos episódios de infecção,⁷ e mulheres portadoras de HIV apresentam maiores taxas de colonização vaginal por Candida, muitas vezes Candida não albicans, do que mulheres HIV-.⁸ As infecções gastrointestinais também estão associadas com a sintomatologia dos pacientes com HIV/AIDS, sendo que dentre os principais agentes etiológicos estão incluídas espécies do gênero Candida.⁹
Estudos epidemiológicos recentes revelaram a substituição das espécies de Candida mais susceptíveis a antifúngicos, como C. albicans, por espécies menos suscetíveis, como C. glabrata e C. krusei.¹⁰ A correta identificação do agente etiológico pode indicar a melhor opção para o tratamento desses pacientes, já que algumas espécies respondem de forma diferente aos agentes antifúngicos.¹¹ A anfotericina B, para o uso endovenoso, está restrita aos casos mais graves, devido às reações adversas frequentes, enquanto a nistatina é utilizada topicamente, pois é demasiadamente tóxica. A utilização de agentes antifúngicos azólicos foi uma das alternativas encontrada para tratar infecções fúngicas, principalmente o fluconazol, devido à sua boa absorção, baixa toxicidade e disponibilidade para o uso oral e endovenoso.^12,13 Entretanto, uma sub-população de pacientes desenvolvem resistência clínica aos agentes antifúngicos convencionais, possivelmente devido a episódios recorrentes de candidíase de mucosa e exposição freqüente ao agente antifúngico.¹⁴
Os fatores de virulência do gênero Candida contribuem no estabelecimento de infecções por microrganismos e principalmente estão relacionadas com o processo invasivo,¹⁵ sendo que a produção de enzimas extracelulares auxilia o processo infeccioso.¹⁶ A alta produção de fosfolipase está correlacionada com um aumento na capacidade de aderência e a maior taxa de mortalidade em modelos animais,¹⁷ enquanto a capacidade de um organismo patogênico adquirir ferro do mamífero hospedeiro, pela produção de hemolisinas, possui grande importância no estabelecimento da infecção.^18,19

O presente trabalho teve como objetivo isolar e identificar amostras de leveduras do gênero Candida em diferentes sítios anatômicos de pacientes HIV, determinar o perfil de sensibilidade aos antifúngicos nistatina, anfotericina B e fluconazol e avaliar os fatores de virulência apresentados (atividade hemolítica e de fosfolipase).


Materiais e métodos



Pacientes

As amostras foram coletadas de pacientes adultos portadores de HIV, na cidade Maringá, estado do Paraná. Todos pacientes participaram voluntariamente do estudo, através da assinatura do termo de consentimento aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos da Universidade Estadual de Maringá.


Cultura

Fezes, secreção vaginal e raspado de mucosa oral coletados foram diluídos em salina 0.9% estéril e semeados em ágar Sabouraud dextrose com 0.02% de cloranfenicol. As placas foram incubadas a 37ºC por 48 h.²⁰ As leveduras isoladas foram estocadas em água destilada estéril entre 24 a 28ºC.²¹


Identificação

Os isolados foram cultivados em meio seletivo diferencial CHROMágar Candida (Difco do Brasil) para a identificação presuntiva das amostras, fornecendo uma coloração diferenciada conforme as espécies em desenvolvimento.²²

A identificação das espécies foi realizada através da reação em cadeia da polimerase (PCR). Primeiramente, o DNA genômico das células leveduriformes foi extraído utilizando o tampão de lise TENTS (10mM Tris HCl pH 8.0 contendo 2% v/v Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl e 1 mM EDTA), 2 pérolas de vidro (2 mm) e fenol saturado, a suspensão foi homogeneizada em agitador por 3 min. A fase aquosa obtida foi desproteinizada com fenol-clorofórmio álcool isoamílico (25:24:1 v/v). O DNA presente na fase aquosa foi precipitado com etanol absoluto por 2 h, lavado com etanol 70% (v/v), seco e ressuspendido com água deionizada estéril. O DNA foi tratado com 1 µl RNAse A (1 mg/ml) a 37ºC por 1 h. Para a identificação dos isolados de Candida sp foram utilizados os seguintes iniciadores: oligonucleotídeo direto universal (CTSF), oligonucleotídeo reverso (CTSR), capazes de amplificar o final da extremidade 3' do DNA ribossomal (rDNA) 5.8 S, a extremidade 5' inicial do rDNA 28 S e a região espaçadora interna. Para realização do segundo ciclo de amplificação foram utilizados oligonucleotídeos espécie-específicos que derivam da região ITS2 C. albicans (CADET), C. parapsilosis (CPDET), C. tropicalis (CTDET) e C. glabrata (CGDET).

Teste de susceptibilidade in vitro aos agentes antifúngicos

A concentração inibitória mínima (CIM) foi determinada através da técnica de microdiluição em caldo.²³ Em microplacas de 96 poços, foi dispensado 100 µl de meio RPMI 1640 pH 7.2 acrescido de Tampão MOPS. As drogas testes foram diluídas seriadamente (1:2) para obtenção das concentrações de 17 a 0.03 ?g/ml para anfotericina B, 64 a 0.125 ?g/ml para nistatina, e 256 a 0.5 ?g/ml para fluconazol. Posteriormente foram semeadas 100 µl da suspensão de leveduras padronizadas para obter uma concentração fúngica final de 1-5 x 10³ UFC/ml. As microplacas foram incubadas em estufa de 37?C por 48 h em uma câmara úmida. A determinação da CIM foi obtida através da observação da ausência de crescimento na menor concentração da droga capaz de inibir o crescimento microbiano in vitro e através da densidade ótica determinada em espectrofotômetro a 492 nm.


Determinação da atividade de fosfolipase e hemolítica

As amostras foram ativadas por 24 h a 37 ºC em caldo Sabouraud e uma suspensão de 1.0 x 10⁶ UFC/ml foi padronizada. Um volume de 5 µl da suspensão foi semeada sobre a superfície de ágar ovo 4% (meio mínimo pH 4.5 suplementado com emulsão de gema de ovo, NaCl 20 g/l e CaCl_2. H₂O 1 g/l) para fosfolipase e um volume de 10 µl sobre a superfície de agar sangue 7% (meio mínimo pH 4.5 suplementado com sangue de carneiro). As placas de Petri foram incubadas a 37 ºC por 96 h. As amostras que apresentaram halo de precipitação ao redor da colônia foram consideradas positivas para atividade fosfolipase.⁶ Para atividade hemolítica as amostras que apresentaram halo de degradação translúcido ao redor da colônia foram consideradas ß-hemoliticos (hemólise semelhante ao controle positivo) e as que apresentaram halo esverdeado foram consideradas a-hemolitico.



Resultados

De um total de 61 pacientes HIV, foram obtidas 100 amostras biológicas provenientes de fezes (26), secreção vaginal (17) e de mucosa oral (57). Dentre as amostras, 45 apresentaram culturas positivas para leveduras e foram isoladas de 29 pacientes em diferentes sítios anatômicos, sendo 41.2 % da vagina (7/17), 43.9% da mucosa oral (25/57) e 50.0 % do trato intestinal (13/26) (Tabela 1). Em 27 pacientes, foram coletadas amostras biológicas de pelo menos dois sítios anatômicos distintos, obtendo cultura positiva nos dois locais em 13 pacientes (48.1%).







No total, 43 amostras foram submetidas ao cultivo em CHROMágar Candida e 36 amostras (18 de secreção oral, 7 de secreção vaginal e 11 de fezes) foram identificadas pelo Seminested PCR. Nove amostras não foram identificadas. A espécie C. albicans foi identificada em 25 amostras (69.4 %) e C. não albicans em 11 (30.6 %), sendo as espécies: 4 C. glabrata, 3 C. parapsilosis , 2 C. tropicalis, 1 C. krusei e 1 Candida sp (Tabela 2).









De 45 leveduras isoladas, 43 (95%) foram submetidas ao teste de susceptibilidade a dois antifúngicos poliênicos (anfotericina B e nistatina) e fluconazol, através da determinação da concentração inibitória mínima. Aproximadamente 25.6% (11/43) dos isolados apresentaram CIM para anfotericina B de 0.28 µg/ml, 46.5% (20/43) CIM de 1 µg/ml para Nistatina, e 25.6% (11/43) CIM de 4 µg/ml para fluconazol. Considerando que fungo que apresentar CIM > 2 µg/ml é considerado resistente a anfotericina B, todas as amostras foram sensíveis. Todas as amostras foram sensíveis a Nistatina, já que apresentaram concentração inibitória mínima inferior a 4 µg/ml. Amostras que apresentaram CIM < 8 µg/ml foram consideradas sensíveis ao fluconazol, representando 60.6% (26/43) das amostras; CIM entre 16 e 32 µg/ml foram consideradas sensíveis dose-dependente (SDD), representando 6.9% (3/43); e CIM > 64 µg/ml foram consideradas resistentes, representando 32.5% (14/43) das amostras (Tabela 3).

A produção de fosfolipase, foi verificada em 62.2% (28/45) das amostras, com halo de precipitação de 1.0 a 1.9 mm. A porcentagem de amostras que apresentou beta-hemólise foi de 86.6% (39/45) e a atividade hemolítica das amostras variou entre 1.1 a 4 mm de beta-hemólise.









Discussão

Apesar dos avanços realizados no tratamento de doenças oportunistas, as infecções fúngicas continuam sendo uma importante causa de mortalidade entre pacientes imunocomprometidos, sendo a candidíase uma das doenças fúngicas mais comuns associadas com a infecção pelo HIV.⁸
O Seminested PCR é um método específico e sensível para o diagnóstico da candidemia e para a identificação de espécies clinicamente importantes de Candida. Através deste método foi possível identificar 36 amostras obtidas de pacientes portadores de HIV/AIDS, verificando uma predominância de C. albicans (69.4%). Candida não albicans também foram identificadas em 10 amostras, representadas por C. glabrata (11.1%), C. parapsilosis (8.3%), C. tropicalis (5.6%), C. krusei (2.8%). Uma amostra foi identificada apenas como Candida sp (2.8%).

Em estudo realizado por Sánchez-Vargas et al.²⁴ com leveduras isoladas da cavidade oral de 111 pacientes mexicanos infectados pelo HIV e 201 não infectados, a C. albicans foi a espécie mais isolada (83.5%) e espécies não albicans (C. glabrata, C. tropicalis, C. parapsilosis) foram isoladas de 16.5% pacientes colonizados. Favalessa et al.²⁵ recuperaram de 102 pacientes, 105 isolados de Candida sp provenientes de distintas amostras clínicas de pacientes infectados pelo HIV, sendo C. albicans o isolado mais freqüente (78.1%). A maior parte dos isolados foram provenientes de secreção de orofaringe (50.5%) e raspado bucal (27.6%).
De um total de 57 amostras obtidas de secreção oral, 43.9% apresentaram cultura positiva para leveduras do gênero Candida, lembrando que cerca de 90% dos pacientes HIV sofrem de candidíase orofaríngea ou esofágica em algum estágio da doença. Da mesma forma, a candidíase vaginal pode persistir em sucessivos episódios de infecção, sendo a segunda causa mais comum de infecção vaginal, e neste estudo, 41.2% das amostras de secreção vaginal foram positivas para candidíase. Por fim, as infecções gastrointestinais também estão associadas com a sintomatologia dos pacientes com HIV/AIDS, causando episódios de diarréia e debilitando ainda mais a saúde do paciente, neste caso, 50% das amostras de fezes apresentaram a presença de leveduras.

O tratamento da candidiase é geralmente baseado em dois grupos de drogas: os azóis e agentes poliênicos. O uso tópico do antifúngico Nistatina costuma ser utilizado no início do tratamento para candidiase oral, entretanto a maioria dos pacientes sofre mais de um episódio de candidiase oral e estes são tratados com fluconazol.¹⁸ A introdução de agentes como o fluconazol permite um tratamento com menor toxicidade que a anfotericina B, podendo ser administrado oralmente, possuindo poucos efeitos colaterais além ser eficaz contra a maioria dos patógenos leveduriformes, incluindo a C. albicans. Entretanto seu uso constante têm sido associado a um aumento da resistência de Candida sp à natureza fungistática dos azóis, o que têm promovido a procura para novos agentes fungicidas.

Através do teste de susceptibilidade foi possível determinar a concentração inibitória mínima de tais antifúngicos que foram capazes de inibir o crescimento leveduriforme. Das 43 amostras submetidas ao teste de susceptibilidade a antifúngicos, todas foram sensíveis a nistatina, apenas 6.9% dos isolados apresentaram resistência à anfotericina B, enquanto a maioria das amostras 60.6% foram sensíveis ao fluconazol, 6.9% sensíveis dose-dependente e 32.5% resistentes ao fluconazol. A categoria de suscetível-dose-dependente (MIC, 16-32 µg/ml) foi estabelecida em resposta aos isolados com susceptibilidade intermediária, ou seja, respondem às doses mais elevadas de fluconazol. A resistência ao fluconazol foi encontrada na maioria das amostras de Candida não albicans, sendo que tal resistência pode ser relacionada a diversos fatores, como o uso prévio de antifúngicos, ou a característica da espécie, como por exemplo, a espécie C. krusei que possui resistência inerente ao fluconazol.

A Candida tropicalis normalmente permanece suscetível a polienos e antifúngicos azóis, no entanto, os isolados clínicos resistentes a azólicos, em particular ao fluconazol, são cada vez mais relatados.²⁶ Em estudo por Bizerra et al.,²⁷ foi mostrado uma elevada resistência ao fluconazol e anfotericina B por C. tropicalis. Outro estudo, realizado por Negri et al.²⁸ com sete isolados de C. tropicalis de culturas de urina, sangue e cateter venoso central, demonstrou que todos os isolados foram capazes de formar biofilme e expressar atividade hemolítica total, sendo sensíveis ao fluconazol e anfotericina B. Apenas um destes isolados produziu fosfolipase.
A C. glabrata têm emergido como um importante e potencialmente resistente patógeno fúngico oportunista, sendo o segundo ou terceiro principal agente de candidíase em todos os locais, incluindo a mucosa orofaríngea e esôfagica. Sua resistência á drogas antifúngicas permite seu crescimento excessivo em relação a outras espécies sensíveis e podem contribuir para o aparecimento de infecções por C. glabrata em populações cronicamente imunocomprometidas²⁹. Dessa forma o aumento da proporção de fungemias devido a C. glabrata tem implicações importantes no tratamento a ser realizado.³⁰

Candida krusei tem-se mostrado como um patógeno hospitalar ocasional, particularmente, em pacientes portadores de doenças hematológicas malignas e/ou submetidos a transplante de medula óssea.³¹ Segundo Hachem et al.,³² os pacientes que tinham doenças hematológicas possuíam maior risco de candidemia causada por Candida não albicans, sendo as espécies C. glabrata e C. krusei as mais comuns. Tal constatação foi associada com o uso prévio de fluconazol como antifúngico profilático. Além da resistência intrínseca ao fluconazol, a C. krusei apresenta claramente uma diminuição da susceptibilidade à anfotericina B e flucitosina. Existe relato da emergência de C. krusei com menor susceptibilidade a caspofungina, como potencial causa de candidíase orofaríngea.³³ Portanto, testes de suscetibilidade desta espécie a estes agentes antifúngicos podem ser justificados para auxiliar na escolha do tratamento.

O aumento da resistência aos antifúngicos e a pouca disponibilidade de novos produtos desenvolvidos pela indústria farmacêutica têm motivado vários estudos sobre a atividade de novos produtos em fungos agentes de infecções humanas, principalmente em pacientes imunodeprimidos.²

Os fungos, incluindo o gênero Candida, são capazes de responder rapidamente às mudanças ambientais, detectando, por exemplo, a queda da imunidade do paciente e tornando-se patogênicos. Os fatores de virulência, como a produção de enzimas extracelulares, facilitam o estabelecimento da doença, já que, a habilidade de secretar enzimas que podem quebrar barreiras ao crescimento do fungo, facilitando a invasão de hifas, e inativar moléculas de defesa, contribuem muito para o processo infeccioso.⁷
A fosfolipase é uma enzima que degrada fosfolipídeos, comuns em todas as formas de vida e estão freqüentemente associadas às membranas celulares, podendo tomar parte do processo de invasão de C. albicans nos tecidos. A determinação da produção enzimática de amostras de C. albicans e outras espécies, isoladas de diversas condições e de diferentes sítios anatômicos, foi observada por vários autores,^17,19,20 que apontaram variações de atividade enzimática entre 50 a 100% para fosfolipase.
Neste trabalho, a maioria das amostras apresentou produção de fosfolipase 62.2% (28/45). Sendo que entre 26 espécies identificadas como C. albicans, 21(80.8%) apresentaram produção de fosfolipase, enquanto que de 10 espécies de Candida não albicans apenas 1 (10%) apresentou produção de fosfolipase, e entre 9 amostras identificadas como Candida sp 4 (44.4%) produziram fosfolipase. Embora tenha sido demonstrado que espécies não albicans podem secretar fosfolipase, é importante ressaltar que estas espécies secretam quantidades significativamente menores de fosfolipase em relação a C. albicans.
A capacidade dos microrganismos patogênicos para adquirir ferro elementar tem demonstrado ser de crucial importância para a sua sobrevivência e a capacidade de estabelecer infecção dentro do hospedeiro. Uma vez que não existe nenhum ferro essencialmente livre no hospedeiro humano a maioria dos patógenos comumente o adquire indiretamente a partir do ferro disponível contido em compostos como a hemoglobina. Para isso, no entanto, o agente deve ser equipado com um mecanismo que destrói os agrupamentos heme e o possibilita extrair o ferro elementar. As enzimas mediadoras de tal atividade são amplamente classificadas como hemolisinas.¹³
A produção desse fator hemolítico pode ser observada pelo crescimento da Candida em meio ágar sangue, enriquecido com glicose, e os termos alfa e beta hemólise denotam hemólise completa e incompleta do meio. Luo et al.³⁴ demonstraram que diversas espécies de Candida não albicans obtidas de fontes clínicas exibiram uma variável habilidade de produzir ambos os tipos de atividade hemolítica. França et al.³⁵ analisaram 28 isolados de C. tropicalis obtidos de diferentes amostras clínicas, como sangue, urina e secreção traqueal, sendo que todos os isolados apresentaram capacidade de promover hemólise in vitro. Neste trabalho, 86.6% (39/45) das amostras isoladas apresentaram beta-hemólise, sendo que os termos alfa-hemólise e beta-hemólise foram utilizados como termos descritivos para indicar incompleta e completa hemólise, respectivamente, associadas às linhagens de Candida testadas. Entre 26 espécies identificadas como C. albicans, 25 (96.2%) apresentaram beta-hemólise, entre 10 espécies de Candida não albicans 5 (50%) apresentaram beta-hemólise, e entre 9 amostras identificadas como Candida sp 7 (77.7%) apresentaram beta-hemólise.

Estudos relatam que a introdução da terapia antiretroviral reduz a prevalência da maioria das infecções oportunistas, incluindo a candidiase oral, portanto, a recuperação da função imune, associada à terapia antiretroviral é um importante fator para diminuir a incidência de candidiases.



Conclusão

Foram isoladas 45 amostras de leveduras de secreção vaginal, oral e fezes, verificando uma predominância de C. albicans (25 amostras). Candida não albicans também foram isoladas e identificadas através de snPCR em 11 amostras, representadas por C. glabrata, C. parapsilosis, C. tropicalis e C. krusei. Considerando o perfil geral de susceptibilidade a antifúngicos utilizados na terapêutica, das 43 amostras, todas foram sensíveis a anfotericina B e a nistatina, enquanto 60.6% foram sensíveis ao fluconazol, 6.9% sensíveis dose-dependente e 32.5% apresentaram resistência ao fluconazol. Sendo que as espécies C. glabrata e C. tropicalis apresentaram valores mais elevados de CIMs para o fluconazol do que os encontrados para C. albicans. Nos testes para determinação de enzimas extracelulares, as quais são importantes na virulência das leveduras, a maioria das amostras apresentou produção de fosfolipase (62.2%) e atividade hemolítica (86.6%).

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