Importance of molecular diagnosis in the extrapulmonary tuberculosis

Abstract
Introduction: Extrapulmonary tuberculosis (EPTB) represents a great diagnostic problem, since Ziehl-Neelsen (ZN) staining and culture are useful but cannot detect an important number of cases due to a paucity of bacilli on smears (paucibacillary). Objective: To determine the utility of the nested polymerase chain reaction (PCR) in the diagnosis of the disease. Material and methods: From September 2002 to February 2008, 469 patients with suspected EPTB were studied. The clinical profile of the patients was evaluated and the corresponding biological samples were obtained. After ZN staining and culture in Lowenstein-Jensen (LJ) were processed, mycobacterial DNA was isolated from specimens and the nested PCR was performed. Results of ZN, culture and PCR were compared. Results: There were 183 confirmed EPTB patients, based on laboratory parameters (either culture isolation of Mycobacterium tuberculosis and ZN or any two, positive PCR), imaging studies and clinical response to therapy. Conclusion: PCR can be considered a valuable adjunct to ZN, culture techniques, imaging studies and response to therapy in the diagnosis of EPTB.

Key words
nested PCR, extrapulmonary tuberculosis

Artículo completo
Introducción
A pesar de la disponibilidad de medicamentos para curar la tuberculosis (TB) desde 1940, esta enfermedad producida por las micobacterias pertenecientes al complejo Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum, M. microti, M. tuberculosis subs. canettii, M. caprae y M. pinnipedii) ocasiona dos millones de muertes al año en el mundo y se estima que cerca de un tercio de la población mundial está infectada por el bacilo M. tuberculosis. La Organización Mundial de la Salud estima que 9.27 millones de nuevos casos de TB se produjeron en 2007 (139/100 000) y que 1.37 millones (14.8%) fueron HIV positivos, comparado con 9.24 millones de nuevos casos (140/100 000) en 2006.¹
La tuberculosis extrapulmonar (TBEP) se presenta como consecuencia de la diseminación de M. tuberculosis a través de los vasos linfáticos o del torrente circulatorio a otros órganos; los afectados con mayor frecuencia son: las meninges, la pleura, la piel, los ganglios linfáticos, el abdomen, el aparato genitourinario, los riñones, la piel, las articulaciones y los huesos.^2,3
Según las recomendaciones internacionales por la OMS, la Unión Internacional Contra la Tuberculosis y Enfermedad Pulmonar (IUATLD, por sus siglas en inglés) y la guía de atención de la TB, existen diferentes criterios para el diagnóstico de la TBEP, como son el estudio clínico, el estudio histopatológico, el criterio epidemiológico y el bacteriológico. El aislamiento del microorganismo en el cultivo es uno de los factores más importantes, pero presenta inconvenientes, especialmente por la sensibilidad, que va del 50% al 81%,^4-7 y por la espera en la identificación del microorganismo (6 a 12 semanas); este tiempo puede prolongarse debido a que las muestras clínicas de origen extrapulmonar, al igual que la TB infantil, son poco bacilíferas (paucibacilares), situación que va en contra del pronóstico del paciente por la demora en la instauración del tratamiento adecuado.^8,9
En México existen pocos informes acerca del diagnóstico molecular de TBEP.^10-12 El desarrollo de pruebas rápidas basadas en biología molecular ha surgido como alternativa de ayuda para el diagnóstico de enfermedades infecciosas.¹³ Entre estas pruebas está la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que se presenta como un método rápido de gran sensibilidad (1 ng/µl de ADN) y especificidad, entre 98% y 100% para micobacterias del complejo M. tuberculosis.¹⁴
Teniendo en cuenta lo anterior, nuestro grupo de trabajo utilizó la PCR para contribuir al diagnóstico de TB en muestras clínicas. El presente trabajo tuvo como objetivo utilizar la PCR anidada, con el fin de ayudar en la detección de TBEP, en pacientes atendidos en el Hospital de Infectología, IMSS.

Planteamiento del problema

Debido a la lentitud de crecimiento del bacilo en medios de cultivo (6 a 12 semanas) y al hecho de que la gran mayoría de las formas extrapulmonares al igual que la TB infantil, son poco bacilíferas (paucibacilares) y por lo tanto negativas al extendido para visualización microscópica, generalmente éstas son tratadas sobre la base de la sospecha clínica, pues no pueden ser confirmadas oportunamente. El diagnóstico de la TB infantil también presenta dificultades, no sólo por la baja proporción con que se logra el aislamiento del bacilo, sino por la gran variedad de manifestaciones de la enfermedad y la no especificidad que las caracteriza. Las formas extrapulmonares de la enfermedad incluyen la TB pleural, meníngea, pericárdica y otras formas que habitualmente son de mayor gravedad que la TB pulmonar (TBP). Aunque las formas extrapulmonares no se consideran importantes en la transmisión de la TB por ser poco bacilíferas, estas formas y las pediátricas representan un problema de importancia en salud pública ya que generan la mayor parte de las muertes, producen altos costos sociales, secuelas y discapacidad, al igual que procedimientos de alto costo, mayores costos institucionales y de hospitalización. Por lo tanto, dadas las dificultades que presentan las muestras de origen extrapulmonar y aquellas obtenidas de niños, la PCR, como técnica de biología molecular, es una técnica sensible para el diagnóstico rápido de los casos de TBEP y pediátrica.


Material y métodos
Población y muestras

De septiembre 2002 a febrero 2008 se estudiaron 469 pacientes, con sospecha de TBEP; de cada uno de ellos se obtuvo igual número de muestras clínicas (Tabla 1). Se recolectaron los datos de los pacientes acerca de edad, sexo, informe de HIV e impresión diagnóstica. El diagnóstico se confirmó por tinción de Ziehl-Neelsen (ZN) (excepto en orina) o cultivo en Lowenstein-Jensen (LJ) o ambos. El diagnóstico inicial de casos de TBEP en general se consideró cuando un paciente presentó síntomas específicos de órgano, además de tener los síntomas sistémicos (fiebre remitente de bajo grado, escalofríos, sudores nocturnos, pérdida de apetito, pérdida de peso, fatiga). Para confirmar el diagnóstico de TB se examinaron las muestras clínicas apropiadas para cada forma de TB, tales como líquido cefalorraquídeo (LCR), orina, materiales de biopsia por microscopia, cultivo micobacteriano y prueba de PCR-TB. También se incluyeron muestras de lavado broncoalveolar (LBA), la mayoría provenía de niños con TBP, ya que estos casos presentan dificultades para realizar el diagnóstico convencional, así como de algunos adultos con formas paucibacilares (ZN/cultivo negativo).








No se incluyó la identificación del paciente en la base de datos utilizada para el estudio. Los procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con los estándares éticos de experimentación en seres humanos de la Declaración de Helsinki y el protocolo de estudio se aprobó por el Comité Local de Ética del Hospital de Infectología, CMNR, IMSS.

Extracción de ADN genómico de micobacterias

El ADN se aisló con isotiocianato de guanidina y fenol, utilizando 500 µl del reactivo TRIzol (Gibco BRL), de acuerdo con el procedimiento descrito por Chomczynski.¹⁵ El ADN se resuspendió en 50 µl de agua destilada después de la precipitación con etanol al 75%. Esta solución se calentó a 55^°C durante 20 min, se determinó su relación de absorbancia a 260/280 nm.


Reacción en cadena de la polimerasa

Se tomaron 5 µl para la amplificación por PCR de los genes que codifican para la proteína de 32-kDa,¹⁶ la proteína específica de especie MTP40¹⁷ y la secuencia de inserción IS6110.¹⁸ Las secuencias de los iniciadores utilizados para amplificar el gen específico de especie fueron: PT1 (5’CGG CAA CGC GCC GTC GGT GG) y PT2 (5’CCC CCC ACG GCA CCG CCG GG), con un fragmento resultante de 396 bp.¹⁹ Para la amplificación del elemento de inserción IS6110, los iniciadores específicos del complejo MBT fueron: IS5 (5’CGG AGA CGG TGC GTA AGT GG) e IS6 (5’GAT GGA CCG CCA GGG CTT GC), con un fragmento de amplificación de 984 bp. Los iniciadores específicos para amplificar el gen que codifica para el antígeno alfa de 32-kDa presente en todas las micobacterias descritas (específico de género) fueron: MT1 (5’TTC CTG ACC AGC GAG CTG CCG) y MT2 (5’CCC CAG TAC TCC CAG CTG TGC), con un fragmento de amplificación de 506 bp.^20-23 Todas las reacciones se llevaron a un volumen final de 50 µl conteniendo 100 ng de ADN purificado tanto de la cepa de referencia como de cada botella de cultivo con desarrollo y confirmado con tinción de ZN, buffer de reacción 1X, 2.5 U de Taq polimerasa, 0.2 mM de cada desoxinucleósido trifosfato y 20 pM de cada uno de los tres pares de iniciadores. La reacción se llevó a cabo en un termociclador (Biometra). Los ciclos incluyeron desnaturalización inicial a 94^°C por 5 min, seguida de 35 ciclos repetidos de desnaturalización a 94^°C por 1 min, alineamiento a 71^°C por 2 min y extensión a 72^°C por 3 min. Después se llevó a cabo una extensión final a 72^°C por 10 min.

Para incrementar la sensibilidad de la amplificación se realizó una PCR anidada, que amplifica un segmento interno del gen específico de especie, diseñado por Del Portillo,¹⁹ los iniciadores internos en la segunda PCR correspondieron a los nucleósidos 44 al 65 (PT3, 5’-CAC CAC GTT AGG GAT GCA CTG C-3’) y 244 al 265 (PT4, 5’-CTG ATG GTC TCC GAC ACG TTC G-3’), que amplificaron una región interna de 223 bp.²⁴ Para este segundo paso, se tomaron 5 µl del producto de PCR múltiple y se transfirieron a 45 µl de una solución premezclada conteniendo los reactivos de PCR a la misma concentración previamente descrita.¹⁶ La amplificación se repitió por 30 ciclos con los mismos parámetros de tiempo y temperatura, como ya se describió anteriormente, excepto para un alineamiento a 75^°C por 2 min, una extensión a 72^°C por 2 min y una extensión final a 72^°C por 7 min.


Visualización de los productos amplificados

Después de la amplificación de los blancos genéticos, 1/10 de la mezcla de reacción de PCR se analizó por electroforesis en agarosa al 1.5% conteniendo 0.5 µg/ml de bromuro de etidio a 70 V/cm durante 45 minutos y se visualizaron con un transiluminador UV. Para determinar el tamaño molecular de los fragmentos de amplificación esperados se utilizó un marcador de peso molecular.


Control de calidad de la PCR

Cada una de las pruebas se procesó con un control positivo para la amplificación utilizando ADN de la cepa de referencia M. tuberculosis H37Rv, un control negativo de amplificación con agua ultrapura estéril para determinar la ausencia de contaminación en el laboratorio y un control de inhibidores que consistió en adicionar una alícuota de ADN de M. tuberculosis H37Rv a la extracción de ADN de la muestra clínica, para corroborar la ausencia de inhibidores en la muestra que no permitieran amplificar un posible ADN micobacteriano presente.²⁵


Emisión de resultados

Los resultados de la PCR para las muestras clínicas se informaron al servicio solicitante. El médico tratante estableció el diagnóstico definitivo.


Resultados y discusión
Características de los pacientes en estudio

De los 469 pacientes, 281 (60%) eran hombres y 188 (40%) mujeres. La proporción hombre:mujer fue de 1:5 (Tabla 1). La mayoría de los pacientes (83%) habían nacido en la Ciudad de México DF, el 17% restante era del Estado de México y del Estado de Hidalgo. La edad media del paciente en estudio fue de 39 años (rango de 1 a 87 años). Algunos resúmenes clínicos no presentaban la información completa, especialmente el informe de la prueba de HIV.


Frecuencia de la distribución de los diferentes tipos de TBEP

De los 183 casos de TBEP, el tipo más común fue TB meníngea (86 casos; 47%); seguido por TB genitourinaria (31 casos; 17%), una de las formas en las que se tiene mayor problema para realizar un diagnóstico certero; TB pleural, linfática, cutánea, peritoneal y pericárdica (24 casos; 13%), y TBP detectada en LBA (42 casos; 23%) (Tabla 2).









Cultivo

Se obtuvieron únicamente 69 (37.5%) cultivos positivos, todos ellos resultaron PCR positivos.

PCR

De 469 muestras provenientes de pacientes con sospecha clínica de TBEP, 183 (39%) presentaron amplificación con los blancos genéticos, en las que se detectó la presencia de ADN de M. tuberculosis; 286/469 (61%) de las muestras fueron negativas y no presentaron amplificación (Tabla 2). Los 61 pacientes con muestra de LCR e informe positivo para HIV, presentaron la PCR positiva constituyendo el 71% de los casos de TB meníngea (Tablas 1 y 2).
En cuanto al manejo de la TBEP basado en la evidencia, los problemas principales en el diagnóstico son cuadros clínicos atípicos que simulan otras enfermedades inflamatorias y neoplásicas, lo que resulta en la demora o la privación del tratamiento. Por lo tanto, un alto índice de sospecha es necesario para realizar un diagnóstico temprano.^8,26 En los países en desarrollo, la falta de recursos diagnósticos se suma a los problemas. Esto a menudo conduce a un tratamiento empírico basado en los argumentos clínicos sin confirmación patológica o bacteriológica, lo que conduce a un sobrediagnóstico y tratamiento innecesario. Esto se demostró en un estudio, en el que sólo 34% de las 373 biopsias hechas en casos clínicamente diagnosticados de TB linfática tuvieron confirmación histopatológica.²⁷ En la práctica clínica, la reacción cutánea de PPD se utiliza como una ayuda para el diagnóstico. Su valor como herramienta diagnóstica es limitado en México, ya que en 1995 la OMS situó a nuestro país entre los primeros 14 países de incidencia de TB; asimismo, de acuerdo con las estadísticas de la OMS, México ocupa la tercera posición en América latina, en cuanto a la incidencia de TBP.

El diagnóstico de TB infantil también presenta dificultades, no sólo por la baja proporción con que se logra el aislamiento del bacilo, sino por la gran variedad de manifestaciones de la enfermedad y la no especificidad que las caracteriza. Las formas extrapulmonares de la enfermedad incluyen TB pleural, meníngea, pericárdica y otras formas que habitualmente son de mayor gravedad que la TBP. Aunque las formas extrapulmonares no se consideran importantes en la transmisión de TB por ser poco bacilíferas, estas formas y las pediátricas representan un problema de importancia en salud pública ya que generan la mayor parte de las muertes, producen altos costos sociales, secuelas y discapacidad, al igual que procedimientos de alto costo, mayores costos institucionales y de hospitalización.
Se presentó la PCR como una buena ayuda diagnóstica, específicamente, por la obtención de resultados en un lapso de tres días después de recibida la muestra; cuando se comunicaba una PCR positiva, se investigaba el diagnóstico médico de los pacientes; en los 183 casos positivos, la clínica confirmó el diagnóstico de TBEP, con lo que se corroboró la contribución de la prueba en el diagnóstico.

La obtención de resultados por PCR en un lapso de 72 horas, tiempo necesario para realizar la extracción, amplificación y detección del ADN micobacteriano, se presentó como una ventaja clínica para el manejo de los pacientes, teniendo en cuenta que a los que se les sospechaba TB meníngea estaban hospitalizados y requerían la pronta instauración del tratamiento.²⁸
En este estudio, la amplificación por PCR confirmó el estado de infección del paciente; el criterio clínico, el epidemiológico y los resultados del apoyo diagnóstico son los que orientaron al médico sobre el curso de la enfermedad. Todas las muestras se procesaron con control positivo, negativo y de inhibidores, lo que permitió asegurar la ausencia de inhibidores (compuestos orgánicos e inorgánicos) en las muestras, que influyeran en la amplificación de un posible ADN micobacteriano presente.²⁵
En la actualidad se cuenta con pruebas como T-SPOT.TB en sangre, la cual es más sensible en formas crónicas de TBEP como la linfática o la osteoarticular.²⁹ Otra prueba es Xpert MTB/RIF, la cual por su facilidad de uso hace que sea aplicable en países endémicos de TB.³⁰ Sin embargo, estas pruebas requieren equipo e infraestructura costosos. Una buena aportación sería el desarrollo de nuevas pruebas inmunológicas económicas para su empleo también en países sin recursos.
Se ha desarrollado una gran cantidad de pruebas de amplificación de ácidos nucleicos comerciales para detectar e identificar el complejo MTB en muestras respiratorias, pero existen pocos informes al respecto acerca de su utilidad en muestras extrapulmonares.^9,31 Se sugiere continuar con este tipo de estudios y avanzar hacia la implementación de la PCR en tiempo real, la cual presenta una mayor sensibilidad en cuanto a la detección del número de copias del posible ADN micobacteriano que se encuentra en una muestra extrapulmonar,³² sin dejar de realizar la identificación microbiológica convencional (baciloscopia y cultivo) establecida por el Programa Nacional de Tuberculosis.

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