Hepatic and Systemic Transforming Growth Factor Beta Expression in Post-Cholecystectomy Bile Duct Injury

Abstract
Bile duct injury is an important clinical problem characterized by the appearance of pro-inflammatory fibrinogenic molecules. Objective: To evaluate the hepatic and systemic expression of transforming growth factor beta (TGF-ß) in post-cholecystectomy bile duct injury. Subjects and methods: Group 1 (control), 3 healthy subjects. Group 2, 37 patients with post-cholescystectomy bile duct injury. Group 2 underwent bilio-digestive reconstruction, 8 weeks after injury. Systemic TGF-ß expression was measured with ELISA. An Hepatic biopsy was analyzed histopathologically and immunohistochemically with anti TGF-ß antibody, quantified with digital AxioVision 4.6.3 support. Results: Group 1 had an average serum TGF-ß level of 904.49 ± 227.24 pg/ml and group 2 of 44 365.71 ± 20 260.61 pg/ml, 48 times more (p < 0.0001 Student's t test). Hepatic inflammation in group 2 was variable, 4th degree in 4 subjects (11%), 3rd degree in 15 (40%), and 2nd degree in 18 (49%). Group 1 showed no inflammatory activity (0 degree). Group 1 had an average hepatic TGF-ß expression of 537.15 ± 330.96 µm², and Group 2 of 1 768.09 ± 1 024.50 µm², 2.3 times more (p < 0.0473 Student's t test). Conclusion: Patients with post-cholecystectomy bile duct tract injury had an increased systemic and hepatic TGF-ß expression.

Key words
TGF-B, bile duct injury, cholecystectomy

Artículo completo
Introducción

Las causas más comunes de cirrosis en el mundo son el consumo excesivo de alcohol¹ y las hepatitis virales.² En México, en el año 2000, las enfermedades hepáticas crónicas fueron la quinta causa de mortalidad.³ La cirrosis biliar secundaria se debe a obstrucción de las vías biliares extrahepáticas por atresia de las vías biliares en la infancia o por lesión de las vías biliares (LVB) en pacientes sometidos a colecistectomía.⁴ La LVB es un accidente con graves consecuencias que se manifiestan por cuadros repetitivos de colangitis que requieren ser tratados con antibióticos de amplio espectro, cirugía prolongada a cielo abierto, riesgo de reestenosis, reoperaciones, cirrosis biliar secundaria, hipertensión portal y, en casos de progresión, la muerte.⁵

La LVB provoca que el hígado no pueda eliminar (drenar) adecuadamente la bilis al duodeno. El mecanismo de daño por acumulación de bilis en el hígado no es muy claro, aunque la obstrucción de las vías biliares produce colestasis con ectasia de ácidos biliares, que al acumularse en los hepatocitos producen daño hepatocelular y propician aumento de la fibrosis en la matriz extracelular (MEC), tal como ocurre en otras enfermedades hepáticas causadas por abuso de alcohol o hepatitis.⁶ La obstrucción biliar produce cambios importantes en las vías biliares, que se manifiestan como estrecheces de los conductos biliares que resultan en cambios histopatológicos complejos con producción de fibrosis hepática progresiva y cirrosis biliar secundaria. Afecta de manera inmediata el estado del hígado y repercute en la salud general del paciente.⁷

Cuando se presenta una LVB se produce inflamación, que contribuye a la remoción de células muertas y propicia la degradación de proteínas de MEC mediante la secreción de metaloproteinasas.⁸ El factor de crecimiento transformante β (TGF-β) representa el mediador central y esencial del proceso de remodelación fibrogénica del hígado al inducir la transdiferenciación de las células estelares hepáticas (CEH) a miofibroblastos y producir el depósito de MEC. Los hepatocitos responden fuertemente al TGF-β, citocina profibrogénica con inducción de apoptosis durante el proceso de fibrogénesis.⁹ Aproximadamente 48 horas después del daño se eleva el TGF-β, estimula las CEH a secretar proteínas de MEC que servirán de soporte para las células que suplirán las que se perdieron por el daño propiciando el depósito de tejido fibroso en el hígado lesionado.¹⁰

Debido al papel que juega el TGF-β en la reparación tisular hepática y en el depósito excesivo de fibrosis cuando se sobreexpresa, se planteó como objetivo evaluar la expresión hepática y sistémica del TGF-β en lesión de vías biliares poscolecistectomía.


Pacientes y métodos

Se realizó un estudio transversal analítico, en el que se formaron dos grupos de estudio. El grupo 1, estuvo integrado por 3 donantes de hígado cadavérico, se tomó biopsia hepática y las laminillas sirvieron como control normal. Se extrajo sangre periférica para control de los niveles séricos de TGF-β. El grupo 2, lo formaron 37 pacientes con LVB poscolecistectomía abierta o laparoscópica, con obstrucción completa de las vías biliares enviados al Departamento de Cirugía General del Hospital de Especialidades del Centro Médico Nacional de Occidente, del Instituto Mexicano del Seguro Social, como hospital de referencia para ser sometidos a la reconstrucción biliodigestiva más conveniente de acuerdo con las características de cada paciente.

Previamente a la reconstrucción los pacientes fueron sometidos a drenaje biliar externo. La reconstrucción biliodigestiva se realizó en forma electiva a 8 semanas de la LVB. Las pruebas de coagulación fueron normalizadas. Los pacientes tuvieron disponible en quirófano sangre total, plasma fresco congelado y vitamina K.


ELISA de TGF-β

Se realizó la prueba comercial de ELISA (R&D Systems) de acuerdo con el protocolo del fabricante. En tubo Eppendorf se agregaron 200 μl de suero; se activó por adición de 200 μl de 2.5 M de ácido acético, se incubó durante 10 min a temperatura ambiente. Se detuvo la reacción al agregar 200 μl de 2.7 M NaOH/1M HEPES. Se preparó una curva estándar de 8 puntos mediante diluciones seriales (1:2). Se adicionaron 100 μl a los estándares, controles y muestras (por duplicado) en la placa. Se incubó con el anticuerpo, los lavados y el revelado. La lectura de la placa se realizó a 450 nm de longitud de onda.


Estudio histopatológico

En la biopsia hepática se evaluaron las características morfológicas e histológicas del parénquima hepático. El tejido se fijó por inmersión en solución de paraformaldehído al 10% preparada a pH neutro con buffer de sales de fosfatos (PBS). Se sometió a deshidratación y se incluyó en parafina. Se realizaron cortes de 5 μm de espesor, se colocaron en portaobjetos silanizados, posteriormente se retiró la parafina de la placa con calor, se hidrató el tejido y se tiñó con hematoxilina y eosina (HyE). La evaluación de las laminillas se realizó mediante el método semicuantitativo.¹¹ Se determinó el grado de inflamación y el estadio de la fibrosis en la zona 1 de Rappaport (zona portal).¹² Las alteraciones histológicas se clasificaron de acuerdo con la actividad inflamatoria portal y lobular en 5 grados: a) grado 0, correspondió a sin portal o mínima inflamación; b) grado 1, inflamación portal sin necrosis y/o inflamación lobular sin evidencia de necrosis; c) grado 2, necrosis de placa limitante leve o necrosis lobular focal o ambas; d) necrosis de placa limitante moderada o necrosis lobular focal grave o ambas, y e) necrosis de placa limitante grave o puentes de necrosis o ambas.¹³


Inmunohistoquímica con el anticuerpo anti-TGF-β

Los cortes de hígado se montaron en laminillas silanizadas, se desparafinaron y rehidrataron. Se usó el kit comercial del anticuerpo monoclonal de humano contra TGF-β1 (Santa Cruz Biotech), las laminillas se incubaron toda la noche a temperatura ambiente con los anticuerpos primarios. La reacción se detectó con el anticuerpo secundario policlonal de cabra diluido en PBS 1:200, revelado con diaminobenzidina y contrateñido con HyE. La marca positiva de la reacción se encontró en color café o marrón oscuro. La evaluación morfométrica cuantitativa se realizó en 5 campos al azar de cada laminilla mediante el programa AxioVision 4.6.3 con analizador de imágenes mediante cámara digital (AxioStar plus, Carl-Zeiss). La escala de medición se expresa en µm². La señal de la cámara es digitalizada al descomponer la imagen en mosaico de pequeños campos. La imagen es interpretada en escala de grises. La imagen se obtiene en aproximadamente 512x512 píxeles, la desigualdad de la imagen se corrige mediante campo blanco.¹³


Análisis estadístico

Los datos se expresan como media ± desviación estándar. Se utilizó la prueba t de Student para las diferencias entre grupos. Se tomó un valor de p < 0.05 como significativo. El análisis de los datos se realizó mediante el programa estadístico Graphpad software 2009.


Consideraciones éticas

El estudio se apegó a la declaración de Helsinki actualizada en el 2000, las leyes locales y nacionales. Se asignaron números de identificación para garantizar la confidencialidad de los pacientes. El protocolo y la forma de consentimiento informado fueron revisados y aprobados por el Comité de Etica e Investigación del Hospital de Especialidades del Centro Médico Nacional de Occidente y del Centro Universitario de Ciencias de la Salud de la Universidad de Guadalajara.



Resultados
Características clínicas generales

Se incluyeron 30 mujeres y 7 hombres en el grupo 2. La edad media fue 44.3 ± 2 años. La LVB se presentó en 20 colecistectomías abiertas (54%) y 17 laparoscópicas (46%). La reconstrucción bilioentérica incluyó procedimientos en Y de Roux y de Hepp-Couinaud; la media de tiempo quirúrgico fue de 6 horas.


Niveles séricos de TGF-β

El TGF-β es la principal citocina profibrogénica y se sobreexpresa en el suero de pacientes con fibrosis hepática. Los pacientes del grupo con LVB mostraron incremento de 48 veces más niveles de TGF-β en suero, con un promedio de 44 365.71 ± 20 260.615 pg/ml, en comparación con 904.49 ± 227.24 pg/ml del grupo control (p < 0.0001 t de Student). De acuerdo con estos datos, surge la necesidad de vigilar de cerca y por largo tiempo a los pacientes con LVB para detectar oportunamente alguna complicación y evitar la cirrosis biliar secundaria (Gráfico 1).







Análisis histológico de la biopsia hepática

Se analizaron cuarenta biopsias de hígado. Las de los tres sujetos sanos no mostraron alteraciones en el parénquima hepático, sólo leve inflamación portal considerando el grado de inflamación con valor de 0. No se observó fibrosis u otro tipo de alteraciones en la zona 1, estas biopsias sirvieron para establecer el patrón normal con respecto a las alteraciones histológicas en el grupo 2, que permitieron definir las características morfológicas del hígado en los sujetos con LVB. Es importante destacar que la LVB podría producir un depósito importante de tejido fibroso en el espacio extracelular. En el análisis de las 37 muestras observadas, los resultados obtenidos del tejido hepático fueron: en relación con el grado de actividad inflamatoria con valor de 4 se encontraron 4 (11%) biopsias; de 3 fueron 15 (40%), y de 2, 18 (49%), lo que refleja diferente grado de inflamación en el tejido hepático.


Inmunohistoquímica con el anticuerpo anti-TGF-β

La expresión de TGF-β en la biopsia hepática, cuantificada mediante inmunohistoquímica del anticuerpo anti-TGF-β, se realizó con el programa digital Axio-Vision 4.6.3 en los integrantes del grupo 1, y mostró en promedio 537.15 ± 330.96 µm², cifra que se consideró como normal. En el grupo 2 se obtuvieron 1 768.09 ± 1 024.50 µm² con aumento de 2.3 veces el valor del grupo 1 (p = 0.0473 t de Student) en tan solo 8 semanas de la lesión (Figura 1) lo que sugiere que la obstrucción de vías biliares perpetúa en poco tiempo el estímulo fibrogénico, al parecer debido al estancamiento de bilis, lo que podría ser suficiente para la activación persistente y la expresión de cantidades aumentadas de TGF-β en el parénquima hepático con repercusión positiva en el depósito de tejido fibroso en la MEC del hígado.







Discusión

Por lo general, el paciente espera una colecistectomía con poco riesgo, estéticamente aceptable y con recuperación rápida; sin embargo, de pronto se transforma radicalmente el panorama, con grandes probabilidades de complicación.^14,15 En el presente estudio la mayoría de los integrantes de la muestra fueron mujeres con una relación de 4:1 de acuerdo con la frecuencia de presentación de la colelitiasis.¹⁶ Todos los pacientes se encontraban en edad productiva con alto riesgo de morbilidad aumentada y de muerte prematura.¹⁷

En los estudios de fibrosis hepática por alcohol o hepatitis C en humanos la biopsia hepática se obtiene por punción, lo que limita la cantidad de tejido hepático a obtener para realizar el amplio análisis del proceso fibrótico, existe además riesgo de errores al interpretar el grado de fibrosis. En los pacientes con LVB sometidos a cirugía para la reconstrucción de las vías biliares es posible la toma de biopsia en cuña, la que es suficiente para hacer la evaluación histológica e inmunohistoquímica ya que supera los 8 espacios porta necesarios para la buena interpretación diagnóstica.

El tiempo de realización la reconstrucción de las vías biliares duró en promedio 8 semanas con el objetivo de evitar las reestenosis tempranas que se presentan en reconstrucciones de lesiones que se descubren durante la colecistectomía y en las que se realizan después de 3 a 6 meses,¹⁸ como fue informado por nuestro grupo previamente.¹⁹

El TGF-β se sobreexpresa en suero y en hígado de pacientes con fibrosis hepática se considera el principal estímulo para la inducción de proteínas de la MEC y se relaciona con todas las enfermedades que cursan con fibrosis. En el presente estudio, el grupo 2 mostró aumentada la expresión del TGF-β en hígado 2.3 veces y 48 veces más en suero tan solo 8 semanas después de realizada la colecistectomía con propensión rápida a fibrosis hepática y si no se resuelve la lesión a cirrosis biliar secundaria.

Es importante mencionar que no siempre los niveles séricos de TGF-β se encuentran aumentados en comparación con controles sanos en las enfermedades hepáticas. En 2001, Daniluk analizó 45 pacientes con cirrosis alcohólica y no encontró diferencias significativas con los controles sanos, aunque al momento del estudio los pacientes ya no ingerían alcohol.²⁰ Nuestros datos son similares a los comunicados por Neuman, que encontró niveles elevados de TGF-β en pacientes con hepatitis C y disminución de los niveles de TGF-β en pacientes que respondieron a los antirretrovirales.²¹ Situación diferente de la de los pacientes con obstrucción biliar crónica por LVB, en quienes mientras no se resuelva la obstrucción, permanece el estímulo.

En otro estudio de cirrosis por hepatitis, se halló una correlación sérica entre la expresión de TGF-β y el depósito de fibrosis hepática, sin embargo, la biopsia fue tomada de pacientes con carcinoma hepatocelular al momento de la extirpación quirúrgica del tumor, por lo que esta patología agregada pudo afectar los resultados.²²

Este es un primer estudio en obstrucción biliar por LVB poscolecistectomía en que se demuestra aumento en los niveles de TGF-β en suero y en biopsias hepáticas en comparación con controles sanos, lo que sugiere una vigilancia prolongada de por lo menos 5 años con alto índice de sospecha para la detección temprana de reestenosis después de la reconstrucción biliodigestiva primaria.²³

Por ser el TGF-β el estímulo fibrogénico más importante, sería interesante conocer otras células y moléculas involucradas en la producción de fibrosis hepática. Se sabe que las células de Kuppfer y las HSC expresan TGF-β, pero la abundancia de las células T natural killer en el hígado o en otras células podría estar presentes como las Treg (Th3) o Th 17, que podrían participar en la producción de TGF-β.

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