Elevated Exhalation of Hydrogen Peroxide and Circulating IL-18 in Patients with Pulmonary Tuberculosis.

Abstract
In our article entitled "Elevated exhalation of hydrogen peroxide and circulating IL-18 in patients with pulmonary tuberculosis" we reveal enhanced local oxidative stress in the study group, which attenuated after 2 months of antituberculous treatment. However, accompanying enhanced ROS production in the airways did not correlate with serum level of IL-18. Our results are confirmed by other studies, indicating enhanced serum and pleural levels of IL-18, which correlate with apoptotic markers in patients with different forms of tuberculosis. During the last two years, there have been no studies into the expired breath condensate of patients with pulmonary tuberculosis. Only in animal models has the significant role of NO in mycobacterial growth inhibition been confirmed. Most progress has been made in accessing the role of IL-18 in innate immunity. It is well-known that only 10% of infected people will suffer from tuberculosis during their whole life and the first line of host defence is crucial for infection containment. By in vitro study, it was found that IL-18 took part in NKT cell activation and restriction of mycobacterial replication. On the other hand, IL-18 could be released by activated NK cells and neutrophils. Moreover, during secretion, two major virulence factors: ESAT-6 and CFP-10 by ESX-1 mycobacterial system IL-18 is also secreted. The enhanced concentration of IL-18 in the microenvironment might exert a protective function during the mycobacterial course of infection.

Key words
tuberculosis, interleukin 18, oxidative stress, hydrogen peroxide

Artículo completo
La tuberculosis es uno de los principales problemas infecciosos de salud en todo el mundo, con 8 a 9 millones de nuevos casos anuales. El principal mecanismo protector del hospedero contra M. tuberculosis es la inmunidad adquirida. Sin embargo, la inmunidad innata, que incluye la respuesta rápida producida por la detección de células infectadas por M. tuberculosis, producción de citoquinas, especies reactivas del oxígeno (ROS) e intermediarios reactivos del nitrógeno (IRN), parece ser crucial en la primera línea de defensa y en el control de la infección.

Durante los últimos 2 años no ha habido estudios que evaluaran el aire espirado de los pacientes con tuberculosis pulmonar, pero se han logrado mejorías significativas en nuestra comprensión de las reacciones inmunitarias contra M. tuberculosis, en especial en relación con la función de la interleuquina 18 (IL-18). Si bien inicialmente la IL-18 se consideró un potente inductor de las citoquinas de los linfocitos T helper tipo 1 (Th1), recientemente se demostró que esta citoquina puede mediar tanto la respuesta inmune de los Th1 como de los Th2.¹ Sólo en unos pocos artículos se demostró el papel de la IL-18 en situaciones clínicas típicas. El-Masry y col.,² como en nuestro estudio, encontraron que los niveles séricos de IL-18 se elevaban significativamente en los pacientes con tuberculosis pulmonar en comparación con los controles sanos, y se correlacionaban positivamente con los niveles séricos del marcador de apoptosis sFas. Además, en la pleuritis tuberculosa las concentraciones de IL-18 y de otras citoquinas de los Th1, como el interferón gamma y la IL-12, se correlacionaron con el sFasL y fueron más elevadas que en los procesos pleurales neoplásicos u originados en causas no neoplásicas y no relacionadas con la tuberculosis.³

Estos autores incluso propusieron que los niveles de las citoquinas de los Th1, así como los de sFasL, podrían ser marcadores diagnósticos útiles en la tuberculosis. Aunque algunos grupos han demostraron recientemente la función de la IL-18 en la regulación de los procesos de apoptosis, estos datos no son coherentes. Mientras que se reveló el papel protector de la IL-18 en la apoptosis mediada por el Fas en los hepatocitos o en los queratinocitos humanos normales,^4,5 Lochner y col.⁶ verificaron de manera inesperada su efecto deletéreo en la primera etapa de la infección por Listeria monocytogenes. En los ratones con deficiencia de IL-18 infectados por L. monocytogenes se observó una reducción de la apoptosis en el bazo, sucedida de un incremento de la eliminación de bacterias durante los primeros 2 a 3 días posteriores a la infección. De todos modos, durante la pleuritis tuberculosa (un modelo típico de inmunidad protectora bien establecida para M. tuberculosis), las citoquinas similares a las producidas por los Th1 que incrementan los marcadores de apoptosis parecen vincularse con un efecto beneficioso.

Es interesante destacar que la producción excesiva de IL-18, una potente citoquina proinflamatoria, también se ha observado durante el curso de otras enfermedades inflamatorias como el shock séptico, la disfunción orgánica múltiple y los eventos cardiovasculares en pacientes con síndrome metabólico.^7,8 Asimismo, aunque en algunos estudios genéticos se demostró un vínculo entre los polimorfismos del promotor de la IL-18 y el riesgo de enfermedad de Alzheimer de comienzo tardío⁹ o de rechazo agudo del injerto en pacientes con trasplante renal,¹⁰ Harinshankor y col.¹¹ no lograron encontrar una asociación con la susceptibilidad o la resistencia en la tuberculosis pulmonar.

Mientras que se reconoce que los linfocitos CD4+ y CD8+ son cruciales en la respuesta inmune contra M. tuberculosis, se conoce poco acerca de la función de los linfocitos natural killer (LNK) y los linfocitos T natural killer (LTNK). Tanto los LNK y los LTNK como los linfocitos T gamma/delta se definen como linfocitos innatos, con un importante papel en la resistencia del hospedero hacia diferentes patógenos. En nuestra opinión, uno de los más interesantes resultados fue descrito recientemente por Soda-Ovale y col.¹² Ellos verificaron que los macrófagos infectados por M. tuberculosis en medios que contenían IL-12 e IL-18 eran capaces de estimular los LTNK con restricción CD1 para incrementar la producción de interferón gamma, la acumulación de óxido nítrico (NO) y, en consecuencia, la supresión del crecimiento bacteriano in vitro. Finalmente probaron que la transferencia adquirida de LTNK protegía a los ratones de la carga bacteriana en los pulmones. Este es el primer estudio en el que se demuestra actividad directa de los LNK contra M. tuberculosis, en contraste con otros ensayos previos en los cuales no se describieron efectos de los LNK durante la infección tuberculosa en los ratones.^13,14

Ren y col. observaron resultados similares, si bien por medio de la activación de diferentes receptores involucrados en la respuesta innata.¹⁵ En modelos con animales, evaluaron uno de los patrones moleculares asociados con el patógeno: los oligodesoxinucleótidos CpG, y el patrón de receptor de reconocimiento (PRR) del receptor 9 tipo toll. En los ratones pretratados con secuencias de nucleótidos CpG antes de la infección por la cepa H37Rv, se comprobó una mayor expresión de IL-18 con subsiguiente incremento del interferón gamma y de la sintasa inducible de NO, que disminuyeron significativamente el número de unidades formadoras de colonias en los homogeneizados de pulmón y el bazo en las semanas tercera y cuarta posteriores a la infección. El aumento de la eliminación de micobacterias en los ratones también dependió principalmente de la actividad de los IRN y de la acumulación de NO y se asoció con la inhibición del crecimiento bacteriano. Se destaca que las células epiteliales pulmonares también pueden producir cantidades bactericidas de NO en respuesta a la infección por M. tuberculosis, por lo cual se incrementa la inmunidad local innata.¹⁶

En los estudios en seres humanos se ha revelado un perfil de citoquinas similar al de los LNK en los sujetos con tuberculosis pulmonar y en los controles sanos.¹⁷ Sin embargo, los LNK producían IL-4 con mayor frecuencia que interferón gamma.

Casi 10 años atrás, nosotros comunicamos la presencia de estrés oxidativo en pacientes con tuberculosis pulmonar.¹⁸ Estos enfermos tenían concentraciones séricas elevadas de productos de peroxidación lipídica, incluidos dienos conjugados y malondialdehído (MDA). En un estudio reciente de Selek y col.¹⁹ se confirmaron nuestros resultados y se demostró un aumento de los niveles circulantes de hidroperóxidos lipídicos y una menor actividad de la paraoxonasa tipo 1, la cual es capaz de metabolizar los peróxidos grasos y evita la oxidación de las lipoproteínas de baja densidad. Dos meses después de un tratamiento antibiótico exitoso, se percibió un descenso de la concentración sérica de MDA en los pacientes con tuberculosis pulmonar.²⁰ Esto fue acompañado por la disminución de los niveles séricos de dos antioxidantes, las vitaminas C y E, pero sólo la concentración de vitamina C se elevó significativamente en respuesta al tratamiento antibiótico.²⁰ Por el contrario, Seyedrezazadeh y col.²¹ percibieron la disminución de los niveles séricos de MDA sólo en los sujetos con tuberculosis pulmonar que recibieron suplementos con vitamina E y selenio. De forma colectiva, en estos estudios se confirmó la existencia de estrés oxidativo sistémico acompañado por el descenso de la concentración de antioxidantes circulantes seleccionados en los pacientes con tuberculosis pulmonar activa.

Se han propuesto algunas explicaciones sobre la función de los fármacos antituberculosos, pero lamentablemente no se ha definido aún su papel en el estrés oxidativo de los sujetos con tuberculosis. Se ha confirmado que las catalasas/peroxidasas son esenciales para el control del estrés oxidativo en M. tuberculosis y de la activación de la isoniazida en su carácter de prodroga.

Aunque en la mayor parte de las micobacterias de crecimiento lento la proteína oxyR parece ser el regulador central de la respuesta al estrés oxidativo, esta molécula ha desaparecido durante la evolución en M. tuberculosis. Para compensar esta deficiencia, la reductasa de alquil-hidroperóxido ha sido involucrada en la respuesta a las ROS y los IRN.²² Recientemente se observó que el estrés oxidativo inducido por la isoniazida no se incrementó con la coadministración de rifampicina en las ratas.²³ Además, la reconocida hepatotoxicidad provocada por la isoniazida en los seres humanos fue mediada por apoptosis inducida por las ROS, según descubrieron Bhadauria y col.²³ en líneas celulares de hematoma (Hep-G2).

En nuestra opinión, el último hallazgo importante es el papel de la IL-18 en la inmunidad innata referida al sistema de secreción ESX-1. El sistema ESX-1 codificado en la región de diferencia 1 (RD-1) y sus sustratos, en especial el objetivo antigénico de secreción precoz tipo 6 (early secreted antigenic target-6 [ESAT-6]) y la proteína de filtrado de cultivos tipo 10 (culture filtrate protein-10 [CFP-10]), constituyen los principales determinantes de la virulencia de las micobacterias. El sistema ESX-1 está implicado en la interrupción de la maduración de los fagosomas, en la formación de granulomas, en la lisis celular y en la secreción de citoquinas. Koo y col.²⁴ establecieron que, después de la fagocitosis de las micobacterias, el sistema ESX-1 provocó la exocitosis de los lisosomas de los macrófagos, así como la liberación de IL-18 e IL-1-beta. No obstante, la secreción de estas citoquinas sólo tuvo lugar en respuesta a los bacilos vivos y fue dependiente del sistema ESX-1, mientras que las micobacterias con deficiencia de este sistema sólo fueron capaces de inducir la síntesis de IL-18 e IL-1-beta sin liberación de estas moléculas desde las células inflamatorias. La posibilidad de escape de las defensas del hospedero de aquellas cepas con RD-1 fue investigada por Smith y col.,²⁵ quienes encontraron que una cepa virulenta de M. marinum pudo inducir la polimerización de la actina para formar poros de membrana, que facilitaban la diseminación bacilar de una célula a otra. Además, esta actividad se correlacionaba con la secreción de ESAT-6. Se destaca que las micobacterias virulentas lograban inhibir también la producción de ROS mediante el uso de estas proteínas secretoras y su complejo ESAT-6:CFP-10,²⁶ con la creación de un entorno más favorable para estos microorganismos. Por lo tanto, el sistema ESX-1, que por un lado parece desempeñar un papel crucial en la virulencia de las micobacterias, puede, por otra parte, ejercer una función protectora en el microambiente durante la infección micobacteriana mediante la producción de IL-18, un potente factor inductor del interferón gamma. Asimismo, se demostró que los macrófagos humanos estimulados con IL-18 e IL-12 podían producir interferón gamma.²⁷

Si bien se conoce parcialmente la misión precisa de los neutrófilos en la infección tuberculosa, es interesante señalar que encontramos una correlación positiva entre la concentración de IL-18 y el recuento de neutrófilos en los pacientes con tuberculosis pulmonar.²⁸ La IL-18 puede inducir la síntesis de IL-8,²⁹ así como la quimiotaxis y migración de los neutrófilos.³⁰ Se agrega que los neutrófilos pueden activar los LNK.³¹ Por lo tanto, es posible que los neutrófilos, por activación de la caspasa-1, puedan además producir IL-18 madura en respuesta a M. tuberculosis. Esta hipótesis se fundamenta en la observación de un incremento de la respuesta temprana a L. monocytogenes (otra bacteria grampositiva intracelular) mediante el aumento de la cantidad de los macrófagos y los neutrófilos en los ratones.

En consecuencia, durante la fase inicial de la inmunidad innata, la mayor producción de IL-18 por los LNK activados, y probablemente por los neutrófilos, en el sitio de la infección por micobacterias estimuló la secreción de interferón gamma, con la comprobación del vínculo entre las respuestas inmunes adquirida e innata. Estos hallazgos respaldan nuestra hipótesis previa sobre la IL-18, la cual une dos fases de la respuesta inmune. Además, como se ha descrito recientemente, los LNK activados ya sea por los monocitos estimulados por M. tuberculosis o bien por la exposición a IL-12, IL-15 e IL-18 provocaron la lisis de los linfocitos T reguladores expandidos (CD4+ CD25+ Foxp3+).³² El Foxp3 es un factor de trascripción, que representa un marcador específico de los linfocitos T naturales reguladores que se expresan en los seres humanos y en los ratones.^33,34 Los linfocitos T reguladores, que constituyen entre el 5% y el 10% de los linfocitos T circulantes, se incrementan en los pacientes con tuberculosis y disminuyen la función de los linfocitos T. Así, esta inhibición de los linfocitos T reguladores podría inclinar el equilibrio de la reacción inmune hacia una acción efectora en lugar de un efecto regulador.

En conclusión, los estudios in vitro y las experiencias con animales de laboratorio tienen las mismas limitaciones y los resultados difieren en cierto modo de aquellos obtenidos en los ensayos clínicos. Sin embargo, los últimos datos traen nuevas perspectivas acerca de la función de la IL-18, especialmente en la inmunidad innata contra M. tuberculosis. De todas maneras, se necesitan más estudios para establecer de manera definitiva el papel de esta citoquina, así como el del estrés oxidativo, en las manifestaciones clínicas y la evolución de la tuberculosis.

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